Konfokales Laserscanning-Mikroskop
Final Report Abstract
Das Konfokale Laserscanning-Mikroskop (CSLM) wird von verschiedenen Arbeitsgruppen des Dahlem Centre of Plant Sciences (Institut für Biologie, FU Berlin) genutzt, um die subzelluläre Organisation von Strukturen und Prozessen in pflanzlichen Zellen aufzuklären. Es hat eine wichtige Rolle bei der Erforschung der subzellulären Kompartimentierung von Metabolismus, Signalperzeption und Signalweiterleitung des Pflanzenhormons Cytokinin. Es konnte u.a. gezeigt werden, dass in Arabidopsis alle drei bekannten Cytokininrezeptoren nicht - wie vermutet - überwiegend in der Plasmamembran, sondern vielmehr in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums (ER) lokalisiert sind. Diese Erkenntnis führte zu einem modifizierten Modell der Cytokininsignalübertragung. Durch Bimolecular fluorescence complementation analysis (BiFC) wurden AHK2-AHK2 Rezeptordimere im ER nachgewiesen. Ferner konnte die subzelluläre Lokalisation von mehreren Proteinen des Cytokininmetabolismus (N-Glycosyltranferasen UGT76C1 und UGT76C2), von Proteinen, die mit CKX1 interagieren (HIPP, Heavy Metal Associated Isoprenylated Plant Protein) als auch von Proteinen, deren Mutation zu einer Reversion des Cytokinindefizienzsyndroms führt (u.a. ROCK1, ein Nucleotid-Zucker-Transporter), sehr detailliert bestimmt werden. In einer weiteren Arbeit wurde die veränderte Entwicklung des Protoxylems in Cytokininmutanten mit Hilfe des CSLM beschrieben. Zur Messung der Frequenz von Ac/Ds Transpositionsereignissen nach Expression von sequenzmodifizierten Transposaseproteinen wurde ein transienter Assay in agroinfiltrierten Nicotiana benthamiana Blättern entwickelt. Dabei wird die Exzision des Transposons aus dem GFP Gen als funktionelle Reversion in Form von einzelnen GFP-positiven Zellen detektiert. Der Assay trug wesentlich zur Charakterisierung einer hyperaktiven Mutante der Ac-Transposase bei. Das CLSM war und ist das wichtigste Werkzeug bei der Untersuchung der Arabidopsis DMP Proteine. DMP1 kodiert für ein 207 Aminosäuren langes Protein mit vier Transmembrandomänen und gehört zu einer kleinen pflanzenspezifischen Genfamilie mit 10 Mitgliedern in Arabidopsis, von denen bislang keines beschrieben war. Die Analyse der subzelluläre Lokalisation mit Hilfe des CLSM führte zu der Erkenntnis, dass DMP1 direkt oder indirekt in die Remodellierung des ER und des Tonoplasten während der Blattseneszenz involviert ist. Mit Hilfe des hochauflösenden Bildgebungsverfahrens des CLSM konnte neben der Zuordnung von CDPKs sowie Enzymen des Stickstoffkatabolismus zu bestimmten Zellkompartimenten, insbesondere auch die polare Lokalisation von NAD(P)H-Oxidasen innerhalb von Pflanzenzellen gezeigt werden. Diese Lokalisation korrelierte mit dem mutmaßlichen Ort der enzymatischen Aktivität und dem Phänotyp der entsprechenden Mutanten, was einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der biologischen Funktion dieser Enzymklasse darstellt. Das CLSM ermöglichte weiterhin Vorversuche zur Etablierung von Kalzium-Imaging anhand simultaner Detektion unterschiedlicher Wellenlängen - eine Voraussetzung für die Verwendung von ratiometrischen Kalziumsensoren wie des Yellow Cameleon 3.6 Konstrukts. Es konnten erstmals intrazelluläre Kalziumkonzentrationen während des Pollenschlauchwachstums von verschiedenen Arabidopsis- Linien verglichen werden, welche in Komponenten der Signaltransduktion mutiert waren. Diese Technologie wird weiterhin von fundamentaler Bedeutung sein, wenn es gilt, verschiedene Mechanismen der systemischen Signalweiterleitung von Stressstimuli im Rahmen der Projekte, die im Zusammenhang mit dem SFB 973 „Priming“ stehen, zu untersuchen. In weiteren Projekten wurde die subzelluläre Lokalisation von Enzymen, die in den Purinkatabolismus involviert sind, bestimmt, von einer Guanosindeaminase und mehreren Nukleotidasen von Arabidopsis. Die Bildung von Glyoxysomen bei der Keimung von Arabidopsis-Samen wurde an GFP-markierten Glyoxysomen in Wildtyp und Purinkatabolismus-Mutanten verfolgt. Ferner wurde das Gerät genutzt, um die subzelluläre Lokalisation eines neu identifizierten Proteins, TUP5, einer Acetylornithinaminotransferase aus dem Argininbiosyntheseweg, zu bestimmen. Im Moos Physcomitrella wurden die Targeting- Vorhersagen und die Funktion der atypisch-langen 5´-Extension einer Ascorbatperoxidase überprüft.
Publications
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Expression, localisation and phylogeny of a novel family of plant-specific membrane proteins. Plant Biology 12 Suppl 1, 140152 (2010)
Kasaras, A. and Kunze, R.
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The cytokinin receptors of Arabidopsis thaliana are locating mainly to the Endoplasmic Reticulum. Plant Physiology 156, 18081818 (2011)
Wulfetange, K., Lomin, S., Romanov, G.A., Stolz, A., Heyl, A., Schmülling, T.
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A hyperactive transposase of the maize transposable element Activator (Ac). Genetics 191,747-756 (2012)
Lazarow, K., Du, M.L., Weimer, R., Kunze, R.
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Arabidopsis senescence-associated protein DMP1 is involved in membrane remodeling of the ER and tonoplast. BMC Plant Biology 12, 54 (2012)
Kasaras, A., Melzer, M., Kunze, R.
