Endosomal signaling in innate immunity
Final Report Abstract
Das pulmonale Collektin Surfactant Protein (SP-)A moduliert in vivo Immunfunktionen in der Lunge, teilweise durch Interaktion und Aktivierung von Alveolarmakrophagen (AM), den dominierenden Zellen im Alveolarraum. Vice versa konstituieren AM den primären Abbauweg von SP-A über den endolysosomalen Weg. Endozytose und Signaltransduktion sind unteilbar miteinander verbundene biologische Funktionen, deren reziproke Verbindung weitestgehend unbekannt ist. In diesem Projekt sollten Proteinen und Kinasen identifiziert und charakterisiert werden, die für das SP-A-induzierte Signaling essentiell sind. Die Analyse isolierter, intrazellulärer Vesikel, die magnetisch-markiertes SP-A enthielten - mittels Flüssigkeitschromatographie/ Massenspektrometrie (LC-MS) - identifizierte Clathrin, den Clathrin-Adaptor-Protein (AP) 2 Komplex, sowie weitere Clathrin-assoziierte Proteine. Die pharmakologische Inhibition von Dynamin verhinderte (I) die Aufnahme von SP-A in die Zelle und (II) die SP-A-vermittelte Stabilisierung von IκB-α, sowohl unter constitutiven Bedingungen als auch nach Lipopolysaccharid (LPS)-Stimulation. SP-A induzierte die Proteinexpression von Clathrin, der α- (α-Adaptin) und µ-Untereinheit (AP2µ) des AP2-Komplexes, der Adaptor-assoziierten Kinase (AAK)1, von NF-κB (p50) und der Protein Kinase CK2α in Makrophagen. Der „knock-down“ der Clathrin Heavy Chain (HC) und der α-Adaptin mittels RNA-Interferenz (RNAi) führte zu einer Reduzierung der basalen Proteinexpression von IκB-α, NF-κB (p50), AAK1 und AP2µ in RAW264.7 Zellen, die auch durch Zugabe von SP-A nicht wieder hergestellt werden konnte. Konfokalmikroskopische Aufnahmen Clathrin HC- und α-Adaptin-depletierter Zellen zeigten im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen eine reduzierte Aufnahme von SP-A durch Makrophagen. Insbesondere α-Adaptin ist für die Modulation des IκB-α/NF- κB Signaltransduktionsweg von Relevanz, da nach einem knockdown sowohl die basale als auch die Stimulus-induzierte TNF-α Ausschüttung signifikant erhöht war. Clathrin, α-Adaptin, sowie Proteinen, die an der Clathrin-vermittelten Endozytose beteiligt sind, kommt eine zentrale Rolle in der basalen Immunhomäostase von Makrophagen zu. Zugleich deuten die dargestellten Ergebnisse darauf hin, dass diese Proteine außerdem endscheidend an der SP-A-vermittelten Immunmodulation beteiligt sind.
Publications
- Pulmonary surfactant protein A enhances endolysosomal trafficking in alveolar macrophages through regulation of Rab7. J Immunol 186(4):2397-411, 2011
Sender V, Moulakakis C and Stamme C
