Konfokales Laserscanning-Mikroskop
Final Report Abstract
Liganden-gesteuerte Ionenkanäle spielen eine entscheidende Rolle in der chemischen Kommunikation zwischen Zellen des Nervensystems, der endogenen Regulation des Membranpotentials und als vermittelndes Element zwischen durch externe Stimuli (z.B. Licht, Duftstoffe) aktivierten Signalkaskaden und der Generation neuronaler Erregung. Das Hauptinteresse unsere Gruppe waren bisher Schaltvorgänge in liganden-gesteuerten Kanälen, die durch intrazelluläre zyklische Nukeotidphosphate aktiviert bzw. reguliert werden (CNG- und HCN-Kanäle). Elektrophysiologische Messungen an nativen und mutierten Kanälen erweiterten in den letzten zwei Jahrzehnten das Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Prozesse erheblich. Komplementär dazu wurde die Bindung der Liganden mit einer Vielzahl von Techniken erforscht. Ein weiter gehendes Verständnis erfordert es, die Bindungs- und Aktivierungprozesse gleichzeitig zu analysieren, da Aktivierung eines Kanals die Bindungseigenschaften ändert und umgekehrt. Die in unserem Labor entwickelte konfokale Patch-Clamp-Fluorometrie ermöglicht es, die Bindung eines fluoreszenzmarkierten Liganden mittels Fluoreszenzmikroskopie und die Kanalaktivierung mittels Patch-Clamp-Technik am selben Patch simultan zu messen. Damit ist es erstmals möglich, alle Komponenten des Aktivierungs- bzw. Regulationsprozesses der Kanäle direkt und synchron zu analysieren und komplexe kinetische Modelle für Bindung und Aktivierung zu entwickeln und quantitative zu bestimmen. Der homotetratmere HCN2-Kanal wird durch Hyperpolarisation aktiviert und durch zyklische Nukleotide reguliert. Als Schrittmacherkanal destabilisiert der HCN2-Kanal das Membranpotential in neuronalen und kardialen Schrittmacherzellen und ist damit für deren Funktion essentiell. Für diesen Kanal konnten wir zeigen, dass die identischen Untereinheiten innerhalb eines Kanals durch sequentielle Ligandenbindung deutlich verschiedene Affinitäten für die Liganden annehmen. Ein aus den Daten bestimmtes komplexes kinetisches Modell beschreibt quantitativ die Regulierung des Kanals durch zyklische Nukleotide gut. So konnten wir jüngst zeigen, dass mindestens 2 Liganden für eine effiziente Aktivierung benötigt werden und der doppelt ligandierte Zustand über weite Potentialbereiche ein stabiles Intermediär bildet. Die vier Untereinheiten der nativen olfaktorischen CNG-Kanäle werden aus bis zu 3 verschieden Genprodukten rekrutiert (2xCNGA2, CNGA4, CNGB1b). Die physiologische Funktion dieser verschieden Untereinheiten ist noch nicht abschliessend geklärt. In einer noch nicht publizierten Studie konnten wir die Funktion der verschieden Untereinheiten bei der Aktivierung klären. Die Untereinheiten besitzen verschieden Affinitäten, die CNGB1b-Untereinheit bindet bei vorhandener Bindungsstelle sogar kein cGMP, beeinflusst aber dennoch die Kooperativität des Kanals erheblich. Auch die Effizienz des Transportes der Untereinheiten zur Zellmembran wird wesentlich von der Stöchiometrie der Untereinheiten bestimmt. Weitere kinetische Untersuchungen mit der schnellen Live-Technik des LSM 710 sind im Gange. Hier wird erwartet, dass wir ein geschlossenes kinetisches Modell für die Aktivierung erhalten. Die mit DFG-Mitteln erneuerte Mikroskopietechnik erweitert den für uns erreichbaren Zeit-, Konzentrations- Spektralbereich. Zusätzlich ermöglicht uns ein spektral aufgelöster Detektor auch spektralähnliche Fluorophore simultan zu verfolgen und z.B. auch den Einfluss selbst starker Autofluoreszenz quantitativ zu kompensieren. Das wird uns bald erlauben, die entwickelten Modelle weiter zu verfeinern und die Technik auf andere Liganden / Rezeptor Systeme anzuwenden. Voruntersuchungen an zwei weiteren Ligandengesteuerten Kanälen sind im Gange.
Publications
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Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels. Neuron. 2010; 67(1): 75-85
J. Kusch, C. Biskup, S. Thon, E. Schulz, V. Nache, T. Zimmer, F. Schwede, K. Benndorf
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Intracellular ion monitoring using a gold-core polymer shell nanosensor archtecture. Nanotechnology 21, 055501 (2010)
S.E. Stanca, S. Nietzsche, W. Fritzsche, C.G. Cranfield, C. Biskup
