Autoradiographie- und Fluoreszenzimager
Final Report Abstract
Das Typhoon Imaging System 9410 wurde genutzt, um radioaktiv bzw. fluoreszenz-markierte RNA-Transkripte zu detektieren und quantitativ zu erfassen. Diese RNAs wurden in Form von in vitro Transkripten als Substrate für den Nukleotideinbau durch verschiedene RNA-Nukleotidyltransferasen eingesetzt. Damit konnte die Substrat- und Reaktionsspezifität dieser Enzyme (in erster Linie tRNA- Nukleotidyltransferasen und Poly(A) Polymerasen) charakterisiert werden. In diesen Arbeiten gelang es, die mechanistischen und funktionellen Charakteristika von CCA-, CC- und A-addierenden Enzymen zu beschreiben. Diese Enzyme addieren das Nukleotidtriplett CCA an das 3‘-Ende von tRNAs, wo es als Aminoacylierungsposition eine essentielle Funktion übernimmt. Es gelang uns dabei, ein Hebel-ähnliches Strukturelement in diesen Enzymen zu identifizieren, das den Spezifitätswechsel von C nach A beim Nukleotideinbau der Nukleotidyltransferasen bewirkt. Wir konnten zeigen, dass CC-Enzymen dieser Hebel fehlt. Weiterhin konnten wir nachweisen, dass dieses Hebel-Element eine sehr ungewöhnliche Evolution aufweist, die völlig unabhängig vom restlichen katalytischen Zentrum verlief. Ein weiteres interessantes funktionelles Element konnten wir vor kurzem in den A-addierenden Enzymen nachweisen. Dieses Element besitzt eine inhibitorische Funktion und beschränkt den Nukleotidtransfer dieser Enzyme auf den Einbau von AMP. Wird das Element entfernt, so ist das Enzym in der Lage, neben AMP auch CMP spezifisch in tRNA einzubauen. Mit diesen Untersuchungen ist es uns gelungen, einerseits die mechanistischen Grundlagen zum Einbau der einzelnen Nukleotide zu aufzudecken, andererseits aber auch die Evolution von CCA-, CC- und A-addierenden Enzymen zu klären. Das Typhoon-Gerät wurde dabei genutzt, um die jeweils entstandenen Reaktionsprodukte zu charakterisieren. In einem dritten Projekt gelang es uns, eine Enzym-Aktivität aus Hefe zu identifizieren, die eine RNA-Editing-ähnliche Reaktion katalysiert. Die in vitro Analyse dieser Reaktion erfolgte ebenfalls mit dem Typhoon-Gerät. Wir konnten dabei zeigen, dass ein Enzymkomplex mit breitem Substratspektrum, der normalerweise in der RNA-Qualitätskontrolle involviert ist, auch Editing-Reaktionen katalysieren und damit unvollständige Transkripte komplettieren kann. Diese Untersuchungen liefern damit eine direkte Bestätigung der Hypothese zur Evolution von RNA-Editing-Ereignissen, nach der zunächst eine promiske Enzymaktivität vorhanden sein muss, die anschließend eine RNA, die durch eine zusätzliche Mutation verändert wurde, durch eine Editingreaktion wieder korrigiert. Unsere Daten geben nun ein erstes Beispiel, welche Eigenschaften eine derartige Aktivität haben muss. In einer zusätzlichen Untersuchung dient uns das Imaging-System zur strukturellen und funktionellen Analyse von markierten Aptameren, die wir mittels SELEX generiert haben. Mittels in line probing Ansätzen können wir dabei die strukturellen Rearrangements verfolgen, die bei der Interaktion mit dem Liganden stattfinden. Dies erlaubt einerseits, den Bindemechanismus zu verstehen, andererseits eine quantitative Analyse der Bindungsaffinitäten durchzuführen und somit ein Maß für die Effizienz der Ligandenbindung zu erhalten. Weiterhin wird der Typhoon 9410 wird im Rahmen des SFB Transregio 67 für die Analytik von Oberflächenreaktivitäten modifizierter Polymerfilme verwendet. Die Polymerfilme entstehen durch Quervernetzung bioabbaubarer Makromonomere und dienen als gut charakterisierbare Träger für artifizielle Extrazelluläre Matrixbestandteile (aECM), die im Transregio entwickelt werden. Mit Hilfe des Typhoons kann die kovalente Modifikation der Oberfläche nach Fluoreszenzmarkierung der aECM analyisert werden. Analog wurden fluoreszenzmarkierte Peptide in Kooperation mit der AG Beck-Sickinger an Filmoberflächen gebunden und die Beladung der Filme quantifiziert. Das besondere Potential des Typhoon 9410 für die beschriebenen Anwendungen besteht in folgenden Punkten: 1) sehr hohe Auflösung der Fluoreszenzscans, 2) Fokussierung des Anregungslichts auf die modifizierte Oberfläche, 3) direkte Messung der Probe mit geringem Hintergrundsignal. Insgesamt ist festzustellen, dass die erzielten Ergebnisse ohne den Einsatz des Typhoon-Systems nicht zu erreichen gewesen wären.
Publications
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(2011) Probing the SELEX Process with nextgeneration Sequencing. PLoS One 6, No. 12, e29604
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