Activated T cell death: molecular mechanisms and implications of T cell function
Final Report Abstract
Zelltod durch Apoptose ist ein zentraler Regulationsvorgang in T-Lymphozyten, sowohl während homöostatischer Proliferation als auch zu Ende einer Immunantwort, wenn expandierte T-Zellklone wieder auf eine der Ausgangszahl ähnliche Anzahl an T-Zellen reduziert werden. Arbeiten der letzten Jahre haben gezeigt, dass diese Formen der Apoptose durch den mitochondrialen Apoptoseweg reguliert werden, der wiederum durch die Aktivitäten der Bcl-2-Proteinfamilie bestimmt wird. Wir hatten in Vorarbeiten zu diesem Projekt Unterschiede in der Apoptose aktivierter T Zellen bei Mäusen mit Defekten im NF-κB- System sowie eine unterwartete Induktion des pro-apoptotischen Proteins Bim durch antiapoptotische Zytokine (IL-2, -7, -15) gefunden. Ziel des Projekts war das Verständnis der Signalereignisse, die diese Effekte regulieren. Die hauptsächlichen Arbeiten befassten sich mit der Regulation von Bim sowie gegenregulatorischen Mechanismen, die die pro-apoptotische Aktivität von Bim kompensieren. Wir haben gefunden, dass die Induktion von Bim-Protein assoziiert ist mit der Induktion von Bim mRNA, und dass die Aktivität der beiden Hauptsignalwege nach diesen Zytokinsignalen (JAK/STAT-Signale sowie PI3K/AKT-Signale) beide für die Proteininduktion notwendig sind. STAT5/6-Bindungsstellen im Bim-Promotor wurden identifiziert; von zwei klaren Bindungsstellen wurde dabei eine eindeutig nach IL-15-Signalen durch STAT5 besetzt, wie durch Chromatin-Immunpräzipitation gezeigt. Dies spricht sehr für eine STAT5-abhängige, transkriptionelle Induktion von Bim durch Zytokinsignale in T-Zellen. Wir konnten weiter zeigen, dass dieselben, Bim-induzierenden Zytokine gleichzeitig das antiapoptotische Bcl-2-Protein Mcl-1 induzieren. Die Regulation von Mcl-1 war allerdings interessanterweise sehr anders und basierte nicht auch transkriptionellen Veränderungen; auch haben wir keinen Hinweis auf eine veränderte Stabilität des Proteins gefunden. Eine spannende Möglichkeit ist die Regulation durch translationale Prozesse. Dies ist nicht einfach zu untersuchen, und wir haben gerade die Systeme etabliert, um diese Frage nun angehen zu können. In der Summe weisen die Daten auf einen differenzierten Regulationsmechanismus der T-Zellapoptose durch Zytokine hin; durch die Induktion von sowohl pro- als auch anti-apoptotischen Proteinen könnten die Zellen in die Lage versetzt werden, schneller auf den Entzug von Zytokinen/Überlebensfaktoren zu regulieren, und dieser Mechanismus könnte eine Rolle bei der Steuerung des T-Zellüberlebens spielen. Die Analyse der möglichen Rolle von NF-κB musste aus technischen Gründen auf die Untersuchung von Bcl-3 reduziert werden. Der Hauptbefund dieser Analysen ist eine reduzierte Induktion des anti-apoptotischen Proteins Mcl-1 durch die o. g. Zytokine. Dieser Defekt könnte eine Erklärung für den beobachteten Überlebensdefekt in diesen Zellen sein. Der molekulare Signalhintergrund des Effekts wird derzeit weiter analysiert. Der letzte größere Teil des Projekts widmete sich der Etablierung eines Systems zur besseren Manipulation und Analyse von Maus T-Zellen. Hierfür haben wir ein kürzlich berichtetes System etabliert und für unsere Belange weiterentwickelt, das experimentell wesentliche Vorteile bietet. Durch ein an- und abschaltbares Hoxb8 (ein Homöoboxprotein, das die Differenzierung von frühen hämatopoetischen Zellen reguliert), können Vorläuferzellen in vitro generiert und beliebig expandiert werden, die zunächst in vitro zu unreifen T-Zellen (DN3/4-Stadium der Thymusentwicklung) differenziert werden können, und die sich nach adoptivem Transfer in Mäusen zu reifen T-Zellen entwickeln können. Hervorstechende Vorteile des Systems sind die einfache Gewinnung aus Knochenmark (ohne die Notwendigkeit ständiger Mausverfügbarkeit) jeder Maus, die einfache genetische Manipulation (durch viralen Gentransfer) sowie die einfachere Möglichkeit zellbiologischer und biochemischer Experimente (durch große Zellzahlen). Wir sind nun dabei, dieses Modell bei unseren weiterführenden Analysen der proximalen Regulation der T-Zellapoptose einzusetzen (Mcl-1-Translation, verschiedene komplexere Defizienzen, Bcl-3-Verlust). Wir erwarten, dass wir mit diesem System noch weitere wesentliche Informationen über die Regulation dieses physiologisch wichtigen Vorgangs erhalten werden.
Publications
- (2013) Mouse Noxa uses only the C-terminal BH3- domain to inactivate Mcl-1. Apoptosis, 18(9):1093-105
Weber, A., Ausländer, D. and Häcker, G.
- (2014) Inhibitor of Apoptosis Proteins are required for effective T cell expansion/survival during anti-viral immunity in mice. Blood, 123(5):659-68
Gentle, I.E., Moelter, I., Lechler, N., Bambach, S., Vucikuja, S., Häcker, G. and Aichele, P.
(See online at https://doi.org/10.1182/blood-2013-01-479543) - (2014) Regulation of Bcl-2 family members Bim and Mcl-1 by IL-15-signaling via JAK/STAT and PI3K/AKT pathways in T cells. Eur. J. Immunol. [Epub ahead of print]
Shenoy A.R., Kirschnek, S., Häcker, G.
(See online at https://doi.org/10.1002/eji.201344238)
