PAPD5 as an example for "dual-use" nucleotidyltransferases in human cells that can act as poly(A) as well as poly(U) polymerases
Final Report Abstract
Ziel des Antrags ist die biochemische Analyse und funktionelle Charakterisierung von PAPD5, einem Mitglied der Familie der Cid1-ähnlichen Proteine in humanen Zellen. Andere Mitglieder dieser Familie von RNA-Nukleotidyltransferasen sind an einer Reihe von Prozessen in Säugerzellen beteiligt, von der Aktivierung ruhender, sog. dormant mRNAs durch Verlängerung des Poly(A)-Schwanzes bis zum Abbau von verschiedenen RNAs infolge der Addition von Oligo(U)- oder Oligo(A)-Schwänzen. Während der ersten beiden Jahre des Antragszeitraums wurde die In-vitro-Aktivität von PAPD5 analysiert und es konnte gezeigt werde, dass das Protein in seinen Eigenschaften bakteriellen und Hefe-Poly(A)-Polymerasen ähnelt, die an oligo(A)-vermittelten RNA-Abbauvorgängen beteiligt sind. Als In-vivo-Substrate konnten mithilfe der CLIP-Analyse ribosomale RNAs als Substrate von PAPD5 identifiziert werden. Im Gegensatz zu den Hefeproteinen Trf4 und Trf5, die in ihrer Aminosäuresequenz PAPD5 ähneln, zeigt PAPD5 in vitro eine robuste Polyadenylierungsaktivität auch in Abwesenheit jeglicher Proteincofaktoren. Dennoch könnten Faktoren wie das zinc-knuckle-Protein ZCCHC7 in vivo für die Bindung bestimmter Substrate notwendig sein. Es konnte gezeigt werden, dass ZCCHC7 mit PAPD5 interagiert, und dass die Menge oligoadenylierter pre-rRNAs in ZCCHC7-depletierten Mauszellen reduziert ist. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass Prozessierungsintermediate von H/ACA-Box-snoRNAs Substrate von PAPD5 sind, wobei adenylierte snoRNA-Spezies nur in Zellen nachgewiesen werden können, die mit siRNAs gegen die Poly(A)-spezifische Ribonuklease behandelt wurden. Da PAPD5 sowohl mit H/ACA-Box-snoRNA-assoziierten Proteinen als auch mit C/D-Box-snoRNA-assoziierten Proteinen interagiert, und auch eigene PAPD5-CLIP-Daten eine Anreicherung von snoRNAs beider Klassen zeigen, wird zur Zeit der Einfluss anderer Exonukleasen allein bzw. in Kombination mit PAPD5 auf die Prozessierung von C/D-Box-snoRNA-Prozessierung in vitro und in vivo untersucht.
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