Rasterkraftmikroskop
Final Report Abstract
Biophysikalische Untersuchungen an Festkörper-unterstützten Membranen: Ziel dieses Projekts ist die Rekonstitution von Protein in und auf Festkörper-unterstützten Membranen. Dazu werden Oberflächenarchitekturen entwickelt, welche eine Fusion von Proteoliposomen in Poylmerunterstützte Membranen ermöglichen. Diese Membranen sollen zur Untersuchung von Diffusion, Wechselwirkungen und Konformationen von Membranrezeptoren eingesetzt werden. Dafür werden mikrostrukturierte Membranen eingesetzt, um einzelne Proteine Proteinkomplexe für längere Zeit zu beobachten. Mittels Rasterkraftmikroskopie wurde bereits die Vesikelbindung und Fusion verfolgt. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich homogene Membranen auf der Oberfläche ausbilden. Zudem konnten Mikrodomänen in den Membranen morphologisch abgebildet werden. Die Verteilung von funktionalisierten Lipidmarkern in Domänen konnte kraftspektroskopisch bestimmt werden. Nanopartikelschichten als spektroskopische Reporter für oberflächensensitive Detektion: Als spektrokopische Sonden für oberflächensensitive Detektionstechniken wurden Oberflächen über elektrostatische Wechselwirkungen mit Gold- bzw. Lanthanidnanopartikeln beschichtet. Eine dichte Anordnung von Goldnanopartikeln konnte mittels Rasterkraftmikroskopie bestätigt und die morphologische Veränderung durch weitere Funktionalisierung mit Copolymeren verfolgt werden. Durch Kombination mit mikrostrukturierter Oberflächenfunktionalisierung konnten so Goldnanopartikel-Arrays für die Detektion von Protein-Protein-Wechselwirkungen über lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz optimiert werden. Mikrostrukturierung von Oberflächen zur funktionalen Organisation von Proteinen: Zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen über Kraftspektroskopie wurden mikrostrukturierte Oberflächenfunktionalsierungen zur funktionalen Immobilisierung von Proteinen entwickelt. Dazu wurde eine Kupplungsmethode entwickelt, die eine effiziente kovalente Immobilisierung von Proteinen über ein kurzes Peptidtag ermöglicht. Auf diesen Oberflächen können Proteine in Arrays immobilisiert werden, so dass kraftspektroskopische Messungen und Kontrollmessungen direkt parallel durchgeführt werden können. Organisation und mechanische Eigenschaften von Zellwand und ihren Sensoren in Hefen: In Hefen ist es möglich, sowohl die Elastizität der Zellwand mit Hilfe der Rasterkraftspektroskopie zu bestimmen, als auch bestimmte Einzelmoleküle an der Zelloberfläche nachzuweisen. Die Elastizitätsmessungen dienen uns zur Untersuchung verschiedener Deletionsmutanten, die sich auf die Beschaffenheit der Zelloberfläche (Zellwand und Plasmamembran) auswirken. Beispielsweise soll hier versucht werden, die Auswirkungen eines Fehlens von Eisosomen erstmals zu bestimmen. Der Nachweis bestimmter Oberflächenproteine erfolgt mit Hilfe eines „His-Tags“ auf Seiten des Zielproteins und einer mit Ni2+-NTA modifizierten Spitze auf Seiten der AFM. Diese Messungen setzen wir zum einen für die in vivo-Messung der Zellwanddicke in verschiedenen Mutanten ein, zum anderen dienen sie zur Vermessung der Oberflächenverteilung und der mechanischen Eigenschaften von Sensoren, die am oberen Ende des Zellintegritäts- Signalwegs in Hefen stehen. Infektion von Epithelzellen durch Salmonellen: Ziel dieses Projekts ist die Analyse der bei der Zellinvasion von polarisierten Epithelzellen durch Salmonellen induzierten Remodellierung des Zytoskeletts. Hierfür werden hochauflösende „Live-cell“ fluoreszenzmikroskopische Verfahren in Kombination mit Rasterkraftmikroskopie eingesetzt. Diese Kombination ermöglicht es einerseits in Echtzeit die Reorganisierung des F-Aktin-Zytoskeletts zu verfolgen und die parallel die auftretenden strukturellen Oberflächenveränderungen der polarisierten Epithelzellen zu erfassen. Diese Ansätze sollen korrelative mikroskopische Analysen erlauben.
Publications
- Diffusion and Interaction Dynamics of Individual Membrane Protein 1. Complexes Confined in Micropatterned Polymer-Supported Membranes. Small 9 (2013), 570-7
Sharon Waichman, Friedrich Roder, Christian P. Richter, Oliver Birkholz, Jacob Piehler
(See online at https://doi.org/10.1002/smll.201201530) - Spatial organization of lipid phases in micropatterned polymer-supported membranes. J. Am. Chem. Soc. 135 (2013), 1189−1192
Friedrich Roder, Oliver Birkholz, Oliver Beutel, Dirk Paterok, Jacob Piehler
(See online at https://doi.org/10.1021/ja310186g)
