Molekulare Organisation von heteropolymeren Tight-Junction-Strängen
Final Report Abstract
Tight Junctions (TJs) regulieren die parazelluläre Permeabilität für Solute in Epithelien und Endothelien und sind essentiell für die Bildung von Organschranken. Eine Modulation der TJs könnte die Wirkstoffaufnahme über Gewebebarrieren, z.B. die Blut-Hirnschranke, drastisch verbessern. Claudine sind hierfür erfolgsversprechende Angriffspunkte, da sie das Rückgrat der elektronenmikroskopisch darstellbaren TJ-Stränge bilden. Die Claudin-Zusammensetzung der TJs bestimmt deren gewebespezifischen Barriereeigenschaften. In diesem Projekt wurde der bisher ungeklärte molekulare Mechanismus der Bildung polymerer TJ-Stränge über folgende Methoden untersucht: Zelluläre Rekonstitution von TJ-Strängen durch Claudin-Transfektion unpolarer Zellen; Lebendzell-Imaging zur Analyse der subzellulären Verteilung, der cis-Interaktionen (FRET, Native PAGE) und der Mobilität von Claudinkonstrukten (FRAP); Analyse der TJ-Strang Morphologie (Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie, Superresolution-Mikroskopie); zielgerichtete Mutagenese und molekulares Modeling. Über diesen Ansatz wurde das Verständnis der molekularen Organisation der TJs verbessert. Abdichtungsfunktion von Cldn5: Die grundlegende Bedeutung der trans-lnteraktion von Cldn5 unter Beteiligung des Extrazellulären Loops 2 (ECL2) für die Abdichtung der Tight Junctions gegenüber Soluten wurde (1.) in vitro in einem epithelialen Monolayer und (2.) in vivo am Beispiel der zerebral-ventrikulären Barriere und deren Rolle bei der embryonalen Entwicklung des Zebrafischgehirns gezeigt. Kompatibilität verschiedener Claudine: Die homo- und heterophilen cis- und trans-lnteraktionen zwischen Claudinen (und TJ-assoziierten MARVEL Proteinen), die in zerebralen Schranken exprimiert werden, sowie deren Auswirkung auf die Mobilität dieser Proteine, deren Fähigkeit TJ-Stränge zu bilden und der Strang-Morphologie wurden systematisch bestimmt. Visualisierung von Claudinen in TJ-Strängen: Es wurden erstmals direkt einzelne Claudinmoleküle in Netzwerken von TJ-Strängen visualisiert, von nichtpolymerisierten Molekülen unterschieden, gezeigt, dass Cldn3 und Cldn5 die gleiche relative Moleküldichte in den TJ-Strängen besitzen und morphologische Strangparameter quantifiziert. Faltung und Assemblierung klassischer Claudine: Hierbei wurden molekulare Determinanten der Proteinfaltung und der Assemblierung von Cldn3 bzw. Cldn5 zu polymeren TJ-Strängen charakterisiert. Chimäre Cldn3/Cldn5-Mutanten und die durch systematische Mutagenese erzielte Wiederherstellung der Fähigkeit dieser Chimären, TJ-Stränge zu bilden, führten zur Identifizierung von Interaktionsrelevanten Resten in verschiedenen Proteinsegmenten. Zudem wurde gezeigt, dass die Claudinsubtyp-spezifische cis-Dimerisierung zur charakteristischen Ultrastruktur der TJs beiträgt. Die experimentellen Daten wurden mit bioinformatischen Methoden kombiniert und erstmal ein experimentell validiertes Volllängen-Modell der bisher unbekannten 3D-Struktur eines Claudins abgeleitet. TJ-Modulation: Die erhaltenen Erkenntnisse zur molekularen Organisation der Tight Junction können genutzt werden, um gezielt Modulatoren zu entwickeln, die die parazelluläre Permeabilität gegen über Molekülen gewebespezifisch, grössenabhängig und reversible steigern könnten. Diese Werkzeuge könnten die parazelluläre Wirkstoffaufnahme z.B. über die Bluthirnschranke erheblich verbessern. Erste Kandidaten wurden bereits getestet.
Publications
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