Structure and function of the membrane insertase YidC
Final Report Abstract
Die zeitliche Verfolgung und Analyse des Membraninsertionsprozesses von YidC-abhängigen Proteinen in einem exakt definierten In vitro System mit gereinigten Komponenten gelang mit Atto-markierten Proteinen. Ein Akzeptor-Farbstoff (ATTO 647N) wurde an die Insertase YidC, ein zweiter (Donor ATTO 520) an das Substratprotein geknüpft. Die zeitaufgelöste Dynamik der Interaktion bzw. Fluoreszenzenergieübertragung beider Farbstoffe führte zu einem FRET-Signal, das Auskunft gab über den Abstand der beiden Farbstoffmoleküle und damit der markierten Proteine im Nanometerbereich. Zusammen mit der Kristallstruktur, die eine japanische Arbeitsgruppe publizierte, führt dies nun zu einem neuen Verständnis der molekularen Abläufe. Die hydrophoben Teile des Substrats werden initial von der Insertase in der hydrophobic slide festgehalten und der hydrophile (in das Periplasma zu transportierende) Teil des Substratproteins findet in der „hydrophilic groove“ einen Zugang zur Membranmitte. Zukünftig sollte hier die Dynamik der Konformations-und Topologieänderungen innerhalb der Insertase während des Übergangs der hydrophilen Domäne des Substrates von der „hydrophilic groove“ in das Periplasma verfolgt werden. Ein zweiter Abschnitt des Forschungsvorhabens war die Untersuchung und Analyse der Vorgänge, wie die Insertase YidC mit dem „lateral gate“ der Sec-Translocase interagiert. Disulfid-Crosslinking Experimente bestätigten zwar die vermuteten Kontaktstellen, jedoch war die Crosslinking Effizienz sehr schwach. Möglicherweise ist die YidC-SecY Bindung dynamisch (on-off) und auch Substrat-gesteuert. Dies soll nun im weiteren Verlauf des Forschungsarbeiten mit gereinigten und fluoreszenzmarkierten Komponenten über FRET an rekonstitutierten Translokase- und Insertasemolekülen in Lipidlayern untersucht werden.
Publications
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