Structure and function of the membrane insertase YidC

• Applicant: Professor Dr. Andreas Kuhn
• Subject Area: Biochemistry
• Term: from 2009 to 2017
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 127405088

• Final Report Year: 2017

Final Report Abstract

Die zeitliche Verfolgung und Analyse des Membraninsertionsprozesses von YidC-abhängigen Proteinen in einem exakt definierten In vitro System mit gereinigten Komponenten gelang mit Atto-markierten Proteinen. Ein Akzeptor-Farbstoff (ATTO 647N) wurde an die Insertase YidC, ein zweiter (Donor ATTO 520) an das Substratprotein geknüpft. Die zeitaufgelöste Dynamik der Interaktion bzw. Fluoreszenzenergieübertragung beider Farbstoffe führte zu einem FRET-Signal, das Auskunft gab über den Abstand der beiden Farbstoffmoleküle und damit der markierten Proteine im Nanometerbereich. Zusammen mit der Kristallstruktur, die eine japanische Arbeitsgruppe publizierte, führt dies nun zu einem neuen Verständnis der molekularen Abläufe. Die hydrophoben Teile des Substrats werden initial von der Insertase in der hydrophobic slide festgehalten und der hydrophile (in das Periplasma zu transportierende) Teil des Substratproteins findet in der „hydrophilic groove“ einen Zugang zur Membranmitte. Zukünftig sollte hier die Dynamik der Konformations-und Topologieänderungen innerhalb der Insertase während des Übergangs der hydrophilen Domäne des Substrates von der „hydrophilic groove“ in das Periplasma verfolgt werden. Ein zweiter Abschnitt des Forschungsvorhabens war die Untersuchung und Analyse der Vorgänge, wie die Insertase YidC mit dem „lateral gate“ der Sec-Translocase interagiert. Disulfid-Crosslinking Experimente bestätigten zwar die vermuteten Kontaktstellen, jedoch war die Crosslinking Effizienz sehr schwach. Möglicherweise ist die YidC-SecY Bindung dynamisch (on-off) und auch Substrat-gesteuert. Dies soll nun im weiteren Verlauf des Forschungsarbeiten mit gereinigten und fluoreszenzmarkierten Komponenten über FRET an rekonstitutierten Translokase- und Insertasemolekülen in Lipidlayern untersucht werden.

Publications

• (2013). Real time observation of single membrane protein insertion events by the E. coli insertase YidC. PLOSone 8, e59023
  Winterfeld, Sophie; Ernst, Stefan; Börsch, Michael; Gerken, Uwe & Kuhn, Andreas
  
• (2014). The C-terminal regions of YidC from Rhodopirellula baltica and Oceanicaulis alexandrii bind to ribosomes and partially substitute for SRP function in Escherichia coli. Mol.Micro. 91, 408-421
  Seitl, Ines; Wickles, Stephan; Beckmann, Roland; Kuhn, Andreas & Kiefer, Dorothee
  
• (2014) How YidC inserts and folds proteins across a membrane. Nature Struc.& Mol.Biol. 21, 435-436
  Dalbey, Ross E & Kuhn, Andreas
  
• (2014). Polarity and charge of the periplasmic loop determine the YidC and Sec translocase requirement for the M13 procoat Lep protein. J.Biol.Chem. 289, 1023-1032
  Soman, Raunak; Yuan, Jijun; Kuhn, Andreas & Dalbey, Ross E.
  
• (2014). The role of the strictly conserved positively charged residue differs among the Gram-positive, Gram-negative and chloroplast YidC homologs. J.Biol.Chem. 289, 35656-35667
  Chen, Yuanyuan; Soman, Raunak; Shanmugam, Sri Karthika; Kuhn, Andreas & Dalbey, Ross E.
  
• (2015). Membrane insertases are present in all three domains of life. Structure 23, 1559-1560
  Dalbey, Ross E. & Kuhn, Andreas
  
• (2016). Membrane targeting and insertion of the C-tail protein SciP. J. Mol. Biol. 428, 4218-4227
  Pross, Eva; Soussoula, Lavinia; Seitl, Ines; Lupo, Domenico & Kuhn, Andreas
  
• (2017). Membrane insertase YidC in bacteria and archaea. Mol. Micro. 103, 590-594
  Kuhn, Andreas & Kiefer, Dorothee