Juvenile neuronale Ceroid-Lipofuszinose: Funktionsanalyse des CLN3-Membranglykoproteins und Analyse der Autophagie in CLN3-defizienten Zellen und Geweben
Final Report Abstract
1. Zur Charakterisierung des CLN3-Membranproteins wurden die Struktur, die intrazelluläre Lokalisation und Sortierung von CLN3 untersucht. Das Protein wird an zwei Asparaginresten in der ersten luminalen Domäne N-glykosiliert. Die N-Glykosylierung ist jedoch nicht essentiell für die intrazelluläre Sortierung zum Lysosom. Chemische Quervernetzungsexperimente zeigten, dass CLN3 in Membranen als Dimer existiert. Durch Expressionsstudien wurde gezeigt, dass CLN3 in Neuronen hauptsächlich in lysosomalen Kompartimenten im Soma lokalisiert ist. Weiterhin wurde durch Mevalonat-Inkorporation und durch Farnesyltransferase-Inhibitoren gezeigt, dass der Cysteinrest in Position 434 der C-terminalen CQLS-Sequenz von CLN3 in vivo farnesyliert wird. In Neuronen ist die Farnesylierung wichtig ist für die lysosomale Sortierung von CLN3 aus endosomalen Kompartimenten. 2. Biochemische und molekularbiologische Analysen von Fibroblasten aus Patienten mit juveniler neuronaler Ceroid-Lipofuszinose und Hirnmaterial aus Cln3 knock-out Mäusen ergaben eine erhöhte Aktivität und Expression der lysosomalen sauren Phosphatase (LAP) und des lysosomalen Membranproteins LAMP-2. In CLN3-defizienten Fibroblasten waren sowohl die mRNA-Transkription, die Biosynthese und die Halbwertszeit der LAP erhöht. Die Daten lassen vermuten, dass lysosomale Dysfunktion und die Akkumulation von Speichermaterial in Lysosomen eine erhöhte Expression der lysosomalen Membranproteine LAP und LAMP-2 induziert. Obwohl die direkte Bedeutung für die Pathogenese der CLN3-Erkrankung bisher noch unklar ist, könnten diese lysosomalen Proteine als potentielle Biomarker für lysosomale Speichererkrankungen Verwendung finden. 3. In dem geförderten Projekt wurde gezeigt, dass CLN3 die Aufnahme der Aminosäure Alanin entlang eines Protonengradienten in whole-cell uptake Assays an transfizierten COS-7 Zellen und Oocyten vermittelt. In dieser Arbeit konnte das erste Mal ein kausaler Zusammenhang zwischen jNCL-assoziierten Punktmutationen und der CLN3-Funktion hergestellt werden. Ob CLN3 auch in vivo den Export der Aminosäure Alanin aus dem Lysosom vermittelt, ist unklar. 4. Störungen der Makroautophagie wurden bei einer Vielzahl von lysosomalen Speichererkrankungen und bei bestimmten CLN-Erkrankungen, wie CLN3, CLN6 und CLN10, beschrieben. Bei dem untersuchten CLN3-Mausmodell wurden Veränderungen der Makroautophagie im Cortex und im Cerebellum erst in sehr späten Alterstadien von 75 Wochen detektiert. Kolokalisierungsanalysen zeigten, dass CLN3 kein Bestandteil neugebildeter Autophagosomen ist. Zusammenfassend ist es unwahrscheinlich, dass Störungen der Makroautophagie kausal sind für die Neurodegeneration bei dem untersuchten CLN3-Mausmodell. Die Befunde lassen vermuten, dass die Akkumulation von Autophagosomen im Gehirn des CLN3-Mausmodells durch deren vermindertem Abbau in dysfunktionalen Lysosomen resultiert. 5. Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren sind wichtige Cargo-Rezeptoren, die lysosomale Enzyme über den Biosynthese und Endozytoseweg zum Lysosom transportieren. Analysen der 300 kDa Mannose- 6-Phosphat Rezeptors (MPR300)-abhängigen Endozytose des lysosomalen Liganden Arylsulfatase B (ASB) zeigten Defekte der proteolytischen Prozessierung und des lysosomalen Abbau endozytierter ASB in CLN3-depletierten Zellen, die nicht durch einen veränderten lysosomalen pH-Wert verursacht wurden. Die MPR300-abhängige Aufnahme und der intrazelluläre Transport zum Lysosom der ASB waren unverändert. Neben einer erhöhten Expression des MPPR300 auf mRNA- und Protein-Ebene war der Rezeptor subzellulär umverteilt aus perinukleären in periphere vesikuläre Kompartimente in CLN3-depletierten Zellen. Die Umverteilung der MPR300 hatte keine funktionelle Auswirkung auf die intrazelluläre Sortierung löslicher Mannose 6-Phosphat-modifizierter Enzyme zum Lysosom. Zusammenfassend wurden gezeigt, dass die lysosomale Dysfunktion bei der CLN3-Erkrankung nicht durch Störungen des intrazellulären Transports neusynthetisierter lysosomaler Proteine auf dem Biosynthese- und Endozytoseweg verursacht wird. Es ist wahrscheinlich, dass neben lysosomaler Dysfunktion auch Störungen im retrograden Transport zwischen Endosomen und dem trans Golgi- Netzwerk bei der Pathogenese der CLN3-Erkrankung bedeutsam sind.
Publications
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(See online at https://doi.org/10.2119/molmed.2010.00241)
