Antibody Facility: Generation and characterization of monoclonal antibodies directed against protein motifs involved in binding prosthetic groups
Zusammenfassung der Projektergebnisse
(i) Wir etablierten erfolgreich den Einzelmolekül-Pull-Down (SiMPULL) und entwickelten eine Reihe Werkzeuge für die praktische Anwendung mit Tags und fluoreszierenden Proteinen. Bezüglich der PROTRAIN Protein war es uns allerdings nicht möglich, molekulare Wechselwirkungen auf der Ebene einzelner Moleküle zu demonstrieren. Die Charakterisierung der Wechselwirkungen auf der Ensemble-Ebene zeigte, dass die schwachen Bindungskonstanten der untersuchten Moco Proteine der Grund war. Wir charakterisierten daher die SiMPULL Technik bzgl. ihrer Fähigkeit auch schwächere Wechselwirkungen bis in den höheren nanomolaren Bereich aufzudecken. SiMPULL wurde dann erfolgreich an einem archaeellen Transkriptionssystem durchgeführt, bei dem Proteine spezifisch direkt im Zell- Lysat über eingeführte unnatürliche Amionosäuren markiert wurden. Das ermöglichte, direkt Interaktionen von coexprimierten Proteinen und sogar strukturelle Information über Einzelmolekülenergietransfer ohne zusätzliche Aufreinigungsschritte zu erhalten. Weitere Experimente mit Ago-Dicer-Wechselwirkungen aus eukaryotischen Zellen bewiesen das Potential der Methode, wenn die Interaktionen stabil und langlebig genug sind. (ii) Gegen Proteine, die in den Forschungsprojekten der Forschergruppe PROTRAIN untersucht wurden, haben wir im Zentralprojekt „Antibody Facility“ zahlreiche monoklonale Antikörper generiert. Die mAk wurden gegen gereinigte rekombinante Proteine, Proteindomänen oder mit Tags versehene Proteine, die von Wissenschaftlern der verschiedenen Projekte geliefert wurden, hergestellt. Die Antikörpercharakterisierung umfasste die Klassenbestimmung und den ELISA. Immunoblotting und Immunopräzipitation wurde in Zusammenarbeit mit den Projektwissenschaftlern durchgeführt. Unsere Strategie hat gut funktioniert und die Ergebnisse, die mit diesen einzigartigen Antikörpern erzielt wurden, waren wichtige Bestandteile von Publikationen. Daher hat sich das zentrale Projekt „Antibody Facility“ für PROTRAIN als sehr nützlich erwiesen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2012), Engineered fluorescent proteins illuminate the bacterial periplasm. Comp. Struct. Biotechnol J. 3(4):1-6
Dammeyer T. and Tinnefeld P.
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(2013) Broad host range vectors for expression of proteins with (Twin) Strep-tag, His-tag and engineered, export optimized yellow fluorescent protein. Microb. Cell Fact. 12:49
Dammeyer T., Timmis K.N., Tinnefeld P.
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(2013) Maturation of the cytochrome cd1 nitrite reductase NirS from Pseudomonas aeruginosa requires transient interactions between the three proteins NirS, NirN and NirF. Biosci Rep. 2013; 33(3)
Nicke T, Schnitzer T, Münch K, Adamczack J, Haufschildt K, Buchmeier S, Kucklick M, Felgenträger U, Jänsch L, Riedel K, Layer G
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Fungal Genet Biol. 2014 Genetic characterization of the Neurospora crassa molybdenum cofactor biosynthesis May;66:69-78
Probst C, Ringel P, Boysen V, Wirsing L, Alexander MM, Mendel RR, Kruse T
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(2015). A Periplasmic Complex of the Nitrite Reductase NirS, the Chaperone DnaK and the Flagellum Protein FliC is essential for Flagellum Assembly and Motility in Pseudomonas aeruginosa J. Bacteriol. Vol. 197-19, 3066-3075
Borrero-de Acuña JM, Molinari G, Rohde M, Dammeyer T, Wissing J, Jänsch, L, Arias S, Jahn M, Timmis KN, Schobert M, Jahn D
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Enzymatic Characterization of Recombinant Nitrate Reductase Expressed and Purified from Neurospora crassa; Fung. Gen. Biol. 80, 10-18, 2015
P. Ringel, C. Probst, T. Dammeyer, S. Buchmeier, L. Jänsch, J. Wissing, P. Tinnefeld, R.R. Mendel, B.M. Jockusch, T. Kruse
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Single-Molecule Photophysics of Fluorescent Proteins on DNA Origami, Sci. Rep. 5, 14075, 2015
I. Jusuk, C. Vietz, M. Raab, T. Dammeyer, P. Tinnefeld
