Antibody Facility: Generation and characterization of monoclonal antibodies directed against protein motifs involved in binding prosthetic groups
Final Report Abstract
(i) Wir etablierten erfolgreich den Einzelmolekül-Pull-Down (SiMPULL) und entwickelten eine Reihe Werkzeuge für die praktische Anwendung mit Tags und fluoreszierenden Proteinen. Bezüglich der PROTRAIN Protein war es uns allerdings nicht möglich, molekulare Wechselwirkungen auf der Ebene einzelner Moleküle zu demonstrieren. Die Charakterisierung der Wechselwirkungen auf der Ensemble-Ebene zeigte, dass die schwachen Bindungskonstanten der untersuchten Moco Proteine der Grund war. Wir charakterisierten daher die SiMPULL Technik bzgl. ihrer Fähigkeit auch schwächere Wechselwirkungen bis in den höheren nanomolaren Bereich aufzudecken. SiMPULL wurde dann erfolgreich an einem archaeellen Transkriptionssystem durchgeführt, bei dem Proteine spezifisch direkt im Zell- Lysat über eingeführte unnatürliche Amionosäuren markiert wurden. Das ermöglichte, direkt Interaktionen von coexprimierten Proteinen und sogar strukturelle Information über Einzelmolekülenergietransfer ohne zusätzliche Aufreinigungsschritte zu erhalten. Weitere Experimente mit Ago-Dicer-Wechselwirkungen aus eukaryotischen Zellen bewiesen das Potential der Methode, wenn die Interaktionen stabil und langlebig genug sind. (ii) Gegen Proteine, die in den Forschungsprojekten der Forschergruppe PROTRAIN untersucht wurden, haben wir im Zentralprojekt „Antibody Facility“ zahlreiche monoklonale Antikörper generiert. Die mAk wurden gegen gereinigte rekombinante Proteine, Proteindomänen oder mit Tags versehene Proteine, die von Wissenschaftlern der verschiedenen Projekte geliefert wurden, hergestellt. Die Antikörpercharakterisierung umfasste die Klassenbestimmung und den ELISA. Immunoblotting und Immunopräzipitation wurde in Zusammenarbeit mit den Projektwissenschaftlern durchgeführt. Unsere Strategie hat gut funktioniert und die Ergebnisse, die mit diesen einzigartigen Antikörpern erzielt wurden, waren wichtige Bestandteile von Publikationen. Daher hat sich das zentrale Projekt „Antibody Facility“ für PROTRAIN als sehr nützlich erwiesen.
Publications
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