Untersuchungen zum Einfluss der Xist-RNA Expression auf die Mikroarchitektur von Chromosomenterritorien in Stammzellen und differenzierten Zellen mittels 3D-Nanoskopie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Rahmen des bewilligten Projekts haben wir einen essentiellen Beitrag zu methodischen Fragestellungen im Kontext eines neuen Verfahrens zur 3D-Superauflösungsmikroskopie (3D-SIM) geleistet und erstmals die Möglichkeiten und Grenzen der Aussagekraft von 3D-FISH in Kombination mit 3D-SIM systematisch untersucht. Mittels 3D-SIM und an diese Technik angepasste Auswertungsverfahren konnten wir ein Konzept zu allgemeinen Prinzipien höherer Ordnungsstrukturen von Chromatin in Säugerzellen unter dem Aspekt einer funktionellen Zellkernarchitektur erstellen. Wir sehen Strukturanalysen und darauf basierende Hypothesen als wichtige Grundlage für weiterführende Untersuchungen zu mechanistischen Analysen. Grundlage unserer Untersuchungen waren vergleichende Analysen transkriptionell kompetenter Territorien mit den kompaktierten Territorien des inaktiven X Chromosoms (Barr body) in weiblichen Säugerzellkernen unterschiedlicher Spezies. Im Einklang mit den durch Hi-C und anschließender Sequenzierung an großen Zellpopulationen gefundenen „proximity patterns“ finden wir eine Organisation von Chromatin in Domänen(cluster). Darüber hinaus konnten wir ein aktives Kernkompartiment (active nuclear compartment, ANC) definieren, in dem Transkription und Replikation stattfinden. Das ANC ist eine funktionelle und strukturell engverzahnte Einheit von Makromolekülen im Interchromatin Compartment mit dekondensierten Chromatinfibern, die um den kompakteren Kernbereich eines Chromatindomänclusters angeordnet sind. Diese Konformation lässt sich mit biochemischen Methoden schwer beschreiben und unterstreicht die Bedeutung der Komplementarität von biochemischen Hochdurchsatz- und mikroskopischen Einzelzellmethoden. In Xi Territorien bleiben die Chromatindomänencluster erhalten, das aktive Kernkompartiment (ANC), das zahlreiche Xist-Foci enthält, ist dagegen weitgehend kollabiert. Im Kontext mit einer kürzlich erschienenen Arbeit, die mittels RNA purification an großen Zellpopulationen eine breite Bindung von Xist-RNA entlang des ganzen X Chromosoms beschreibt, spricht unsere Beobachtung einer fokalen Verteilung von Xist RNA als „Momentaufnahme“ von einzelnen Zellen für eine dynamische Assoziation von Xist-RNA an regulatorische Sequenzen bzw. an Gene, die in Xi stillgelegt wurden. Die Anerkennung der generellen Bedeutung einer funktionell definierten Zellkernarchitektur zeigt sich an einem kürzlich vom National Institute of Health (NIH) initiierten „4D Nucleome Program“ mit dem Ziel, Zellkernarchitekturforschung mit einem breiten Methodenspektrum und weit gefassten Fragestellungen in den Kontext der genetischen und epigenetischen Forschung zu integrieren (https://commonfund.nih.gov/planningactivities). Dieses Initiative wurde kürzlich vom NIH bewilligt und soll 2015 mit einer Laufzeit von acht Jahren gefördert werden. Einer der Antragsteller (T.C.) wurde als einer von zwei in Europa ansässigen Wissenschaftler in das aus insgesamt fünfzehn Personen bestehende Expertengremium dieses Programms gewählt.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2010) Chromosome territories. Cold Spring Harb Perspect Biol 2: a003889
Cremer T and Cremer M
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(2011) 3D-image analysis platform monitoring relocation of pluripotency genes during reprogramming. Nucleic Acids Research 39 (17): e113
Jost KL, Haases S, Smeets D, Schrode N, Schmiedel JM, Bertulat B, Herzel H, Cremer M, Cardoso MC
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(2011) A top-down analysis of Xa- and Xi-territories reveals differences of higher order structure at ≥20 Mb genomic length scales. Nucleus 2 (5): 465-477
Teller K, Illner D, Thamm S, Casas-Delucchi CS, Versteeg R, Indemans M, Cremer T, Cremer M
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(2012) The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture. BioEssays 34 (5) 412-26
Markaki Y, Smeets D, Fiedler S, Schmid VJ, Schermelleh L, Cremer T, Cremer M
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(2013) Fluorescence in situ hybridization applications for super-resolution 3D structured illumination microscopy. Methods Mol Biol 950: 43-64
Markaki Y, Smeets D, Cremer M, Schermelleh L
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(2014) Application of three-dimensional structured illumination microscopy in cell biology – pitfalls and practical considerations. Neuromethods 86: 167-188
Smeets D, Neumann J, Schermelleh L
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(2014) Spatial separation of Xist RNA and polycomb proteins revealed by super-resolution microscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 111: 2235-40
Cerase A, Smeets D, Tang AY, Gdula M, Kraus F, Spivakov M, Moindrot B, Leleu M, Tattermusch A, Demmerle J, Nesterova T, Green C, Otte AP, Schermelleh L, Brockdorff N
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(2014) Three-dimensional super-resolution microscopy of the inactive X chromosome territory reveals a collapse of its active nuclear compartment harboring distinct Xist RNA foci. Epigenetics & Chromatin 7:8
Smeets D, Markaki Y, Schmid VJ, Kraus F, Tattermusch A, Cerase A, Sterr M, Fiedler S, Demmerle J, Popken J, Leonhardt H, Brockdorff N, Cremer T, Schermelleh L, Cremer M
