Analysis of the dynamics of the cellular immune response during abscess formation by intravital two-photon-microscopy
Final Report Abstract
Intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie (2PM) erlaubt die Untersuchung von Gewebe im lebenden Modellorganismus in Echtzeit. Eine relativ neue Anwendungsmöglichkeit dieser Technik ist die Visualisierung von Interaktionen zwischen Wirt und Erreger auf Einzelzellebene im Verlauf einer Infektion. Während verschiedene Aspekte bakterieller, viraler und parasitärer Infektionsmodelle bereits mit Hilfe der 2PM untersucht wurden, gab es bislang keine Informationen über den Verlauf einer S. aureus-Infektion in hoher zeitlichräumlicher Auflösung. Ziel des geförderten Projekts war, ein Experimentalsystem zu etablieren, das die Beobachtung der Immunzellmigration während der frühen Abszessbildung in einem murinen S. aureus-Hautinfektionsmodell ermöglicht. Im ersten Schritt wurde eine Reihe von bakteriellen Reporterstämmen generiert, die codonadaptierte fluoreszierende Proteine (FP) exprimieren. Die Verwendung des konstitutiv aktiven sarA P1-Promoters erlaubt eine stabile Markierung der Zellen unabhängig von der Wachstumsphase, während eine FP-Expression unter Kontrolle des agr P3-Promoters die Aktivität des wichtigen Quorum-Sensing-Systems und Virulenzregulators Agr anzeigt. Als nächstes wurde eine Technik entwickelt, die die Beobachtung der Haut an der Flanke einer lebenden Maus mit Hilfe der 2PM ermöglicht, wobei der Blutfluss im Hautlappen erhalten bleibt. Es konnte dargestellt werden, dass sich injizierte Staphylokokken auch in geringer Keimzahl in der Dermis visualisieren lassen. Anstatt der ursprünglich vorgesehenen IL-17F-mRFP-Mäuse, die eine zu geringe Reporterfluoreszenz aufwiesen, wurden stattdessen LysM-EGFP-Mäuse untersucht, um die Immunzellmigration infolge der Infektion mit S. aureus zu analysieren. Hier lassen sich in der nicht infizierten Haut v.a. sessile Makrophagen in der Dermis beobachten, während es innerhalb von wenigen Stunden nach Injektion der Bakterien zu einem Einstrom von neutrophilen Granulozyten (PMN) ins extravaskuläre Gewebe kommt. Diese Zellen zeigen eine starke migratorische Aktivität in Richtung des Infektionsfokus. Depletion der Neutrophilen verhindert die Entwicklung eines zellulären Infiltrats, was zur ungehinderten Vermehrung der Bakterien führt. Die Vorbehandlung der Maus mit Pertussis-Toxin unterbindet ebenfalls die Akkumulation von PMN am Ort der Infektion und bestätigt, dass G- Protein-gekoppelte Rezeptoren (z.B. Chemokin- und Formylpeptid-Rezeptoren) für die Rekrutierung der Zellen benötigt werden. Durch den adoptiven Transfer von ex vivo unterschiedlich fluoreszenzmarkierten PMN wurde gezeigt, dass diese Rezeptoren auf den Neutrophilen selbst vorhanden sein müssen. Im Gegensatz dazu ergab der gleichzeitige Transfer von Wildtyp- und Interleukin-1-Rezeptor-(IL-1R)-Knockout-PMN, dass IL-1R auf anderen Zellen des Wirts, aber nicht auf den Neutrophilen selbst, für eine suffiziente Auswanderung der Neutrophilen zum Ort der Infektion benötigt wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der von vielen Staphylokokken exprimierte Komplementinhibitor Ecb die Rekrutierung von PMN zum Ort der Infektion verhindern kann. Mit Hilfe der o.g. S. aureus-Reporter konnte zudem das Verteilungsmuster der Agr-Aktivität innerhalb der bakteriellen Population während der Anfangsphase der Infektion untersucht werden. Überraschenderweise wurde eine Hochregulation von Agr vor allem im Randbereich des Infektionsfokus detektiert. Dies widerspricht dem Konzept einer Detektion der Bakteriendichte durch das Quorum-Sensing-System, was die stärkste Agr-Aktivität in der Mitte der Bakterienpopulation hätte vermuten lassen. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass das beschriebene Experimentalsystem die Beobachtung verschiedenster Aspekte (Immunzellmigration und beteiligte Signalwege, bakterielle Virulenz und Genregulation) auf Einzelzellebene in vivo ermöglicht und daher eine Vielzahl von Anknüpfungsmöglichkeiten für zukünftige Untersuchungen in diesem Modell erlaubt. Darüber hinaus kann das erworbene Know-how auch auf die Anwendung der intravitalen 2PM in anderen Infektionsmodellen übertragen werden.
