Einzelmolekülstudien zur linearen Diffusion von sequenzspezifischen Endonukleasen
Final Report Abstract
Proteine, die spezifische Sequenzen auf der DNA im hohen Überschuss unspezifischer Sequenzen erkennen müssen, sind meist auf besondere Mechanismen angewiesen, um diese ausreichend schnell, entsprechend den biologischen Anforderungen, zu finden. Bei dieser sogenannten erleichterten Diffusion wird der 3D-Suchprozess durch eine 1D-Komponente ergänzt. Wir konnten für drei Restriktionsendonukleasen mit unterschiedlicher Struktur zeigen, dass sich der Suchprozess aus verschieden langen Phasen des „sliding“ (1D- Bewegung) unterbrochen durch „jumps“ (3D-Bewegung) zusammensetzt. Für die Restriktionsendonuklease EcoRV konnten wir erstmals nachweisen, dass das Protein beim sliding der großen Furche der DNA und somit der helikalen Struktur der DNA folgt. Das Enzym kann somit kontinuierlich die Sequenzinformation der großen Furche der DNA auslesen. An DNA Sequenzen, die sich von der kognaten Erkennungsequenz nur um ein Basenpaar unterscheiden (sog. star sites), können im Suchprozess von EcoRV Pausen auftreten, hier werden nahezu alle für die spezifische Bindung notwendigen Wechselwirkungen ausgebildet. Auch kleinere Deformationen der Geometrie der DNA führen zu einer drastischen Abnahme der Diffusionsgeschwindigkeit von EcoRV. Für die thermophile Restriktionsendonuklease BsoBI zeigen die Befunde der fluoreszenzspektroskopische Einzelmolekülmessungen, dass neben der bekannten Struktur im Komplex mit der spezifischen Erkennungssequenz, eine weitere Proteinkonformation existiert, bei der das Enzym eine geöffnete Struktur einnimmt, die das silding und jumping erst ermöglicht. Die im Projekt erzielten Ergebnisse machen deutlich, wie die untersuchten Restriktionsendonukleasen ihre spezifische Zielsequenz auf der DNA finden. Die methodischen Weiterentwicklungen werden es erlauben auch andere Proteine zu untersuchen und eine höhere Auflösung zu erzielen.
Publications
- (2009). Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys. J. 96, L50-52
Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A. & Desbiolles, P.
- (2012). The rotation-coupled sliding of EcoRV. Nucleic Acids Res. 40, 4064-4070
Dikic, J., Menges, C., Clarke, S., Kokkinidis, M., Pingoud, A., Wende, W. & Desbiolles, P.
- (2013). STED nanoscopy combined with optical tweezers reveals protein dynamics on densely covered DNA. Nat. Methods 10, 910- 916
Heller, I., Sitters, G., Broekmans, O. D., Farge, G., Menges, C., Wende, W., Hell, S. W., Peterman, E. J. & Wuite, G. J.
