Anthranilat: CoA Ligasen aus Rutaceen
Final Report Abstract
Pflanzliche CoA-Ligasen, die Benzoesäuren aktivieren, unterscheiden sich von Zimtsäure: CoA-Ligasen, da nur das eine oder andere Substrat akzeptiert wird. Obwohl die Enzyme nah verwandt sein müssen, konnten die entscheidenden Unterschiede in den Gensequenzen bisher nicht charakterisiert werden. Entsprechend führten degenerierte Primer, abgeleitet aus 4- Cumarat:CoA-Ligase (4CL) Genen, nicht zur Amplifizierung von Sequenzen für Benzoesäure: CoA-Ligasen. Die Biosynthese von Acridonalkaloiden zweigt mit der Aktivierung von Anthranil- bzw. 7V-Methylanthranilsäure vom Primärstoffwechsel ab, und die Identifizierung der beteiligten CoA-Ligase(n)-Transkripte komplementiert den Weg zu Acridonen auf der molekularen Ebene und würde vermutlich helfen, das auf Rutaceen limitierte Vorkommen dieser Alkaloiden zu erklären. Die Versuche zur cDNA-Amplifizierung einer solchen CoALigase mit degenerierten Primern wurden fortgesetzt, führten aber nicht zum Erfolg. Parallel wurde die traditionelle Reinigung von (A'-Methyl)-anthranilat:CoA-Ligasen aus induzierten Kulturen von Ruta graveolens durchgeführt. Für diese Verfahrensweise ist ein empfindlicher und zuverlässiger Enzymtest Voraussetzung. Anders als die 4CL-Aktivierung lässt sich aber die Aktivierung von Benzoesäuren nicht photometrisch verfolgen. Deshalb wurde ein gekoppelter Test verwendet, der die Umsetzung von 7V-Methylanthraniloyl-CoA mit rekombinant hergestellter Acridonsynthase nutzt. Mit dieser Methode konnte eine CoALigase Fraktion weitgehend angereichert werden, aber die Labilität des Enzyms und die nicht ausreichende Sensitivität des Tests sowie die technisch veraltete Ausstattung verhinderten eine Reinigung zur Homogenität. Eine Verbesserung der Testbedingungen wurde durch die Amplifizierung der SAM:Anthranilat 7V-Methyltransferase aus Ruta-Zellen erzielt, weil mit dem rekombinant exprimierten Enzym spezifisch hoch markiertes Substrat hergestellt und der Test vereinfacht werden konnten. In diesem Status endete die Tätigkeit der Arbeitsgruppe, jedoch liegen nun alle Voraussetzungen für eine erfolgreiche Isolierung der (N-Methyl)- anthranilat:CoA-Ligase(n) aus Ruta graveolens vor.
Publications
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