Protein integration into the mitochondrial outer membrane

• Antragsteller: Professor Dr. Doron Rapaport
• Fachliche Zuordnung: Biochemie
• Förderung: Förderung von 2009 bis 2016
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 140350888

Die mitochondriale Außenmembran (MAM) vermittelt eine Vielzahl an Wechselwirungen zwischen mitochondrialem Metabolismus sowie Erbgut und dem Rest der eukaryotischen Zelle. Im Rahmen der Biogenese des Organells müssen neu synthetisierte Membranproteine in die Lipiddoppelschicht eingebettet werden. Ein Großteil dieser Membranproteine weist eine oder mehrere -helikale Transmembrandomänen auf. Obwohl in letzter Zeit immer die Bedeutung dieser Proteine für zellbiologische Prozesse deutlicher wurde, ist unser Wissen über ihre Biogenese rudimentär. Das allumfassende Ziel des vorliegenden Forschungsvorhabens ist es, die biologischen Prozesse und molekularen Mechanismen aufzuklären, die der Biogenese der MAM Proteine zugrunde liegen. Wir werden uns auf zwei Typen der MAM Proteine konzentrieren: zum einen solche, die mit einer Transmembrandomäne in der Außenmembran verankert sind und eine lösliche Domäne sowohl im Cytosol als auch im Intermembranraum besitzen (single-span) und zum anderen die Gruppe der Membranproteine, die mehrere -helikale Transmembrandomänen aufweisen (multi-span). Wir wollen die folgenden Fragen beantworten:1) Wie werden single-span Membranproteine von Mitochondrien erkannt und in die mitochondriale Außenmembran inseriert? Welche Proteine sind am Membranintegrationsmechanismus beteiligt?2) Welcher molekulare Mechanismus liegt der Insertion der multi-span Proteine zugrunde? Welche genauen Funktionen haben dabei Mim1 und das neu von uns entdeckte MAM Protein Mim2? Gibt es bislang noch unbekannte weitere Komponenten, die in diesem Prozess eine Rolle spielen?Zu diesem Zweck werden wir uns die Möglichkeiten der Hefegenetik zu Nutze machen und in vitro, in organello und in vivo den Import von Modellproteinen in Mitochondrien der wildtyp Hefe sowie mutierter Hefestämme analysieren. Um Proteine zu identifizieren, die mit single-span Proteinen interagieren, werden wir photo-induced crosslinking Experimente durchführen. Außerdem werden wir mutierte single-span Proteine dazu verwenden um die Unterschiede zwischen deren Insertionsmechanismus und dem der sogenannten tail-anchored Proteine zu verstehen.Wir werden den MIM-Komplex isolieren und in künstlichen Lipidvesikeln funktionell rekonstituieren, um die Membranintegration von multi-span Proteinen zu analysieren. Darüber hinaus werden wir einen automatisierten systematischen Fluoreszenzmikroskopie-Screen durchführen um neue Komponenten zu identifizieren, die an diesem Prozess beteiligt sind. Dabei werden GFP-Fusionsproteine in zwei sich ergänzenden Hefedeltionsstammsammlungen, welche das komplette Hefegenom abdecken, exprimiert und analysiert.Zusammenfassend wird unser Forschungsvorhaben maßgeblich dazu beitragen, die bedeutenden Prozesse der Biogenese der mitochondrialen Außenmembran auf molekularer Ebene zu verstehen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen