Die Rolle der Transkriptionsregulator-Familie TrmB bei der Regulation des Kohlenhydrat-Stoffwechsels in Pyrococcus furiosus
Final Report Abstract
Im Rahmen dieses Projektes wurde die Rolle der Transkriptionsregulator-Familie TrmB bei der Regulation des Kohlenhydrat-Stoffwechsels in Pyrococcus furiosus anhand von in vitro und in vivo Experimenten genauer untersucht. Für die geplanten in vivo Versuche wurde zunächst das für Pyrococcus furiosus entwickelte genetische System erweitert, um zusätzlich Modifikationen direkt im Genom durchführen zu können. Durch die Deletion der hypoxanthin-guanin phosphoribosyltransferase konnte zudem ein Pyrococcus Stamm erstellt werden, der markerlose Modifikationen über den sog. ´Pop-in/Pop-out´-Mechanismus ermöglicht. Die Funktionsfähigkeit des genetischen Systems konnte im Rahmen dieses Projektes durch die Einführung einer Punktmutation in der Untereinheit H der RNA-Polymerase sowie durch die Deletion eines Nukleotides im Bereich der Chitinase bestätigt werden. Für die Aufklärung der Funktion von TrmBL1 wurde im Rahmen dieses Projektes ein ChIP-Seq-Ansatz entwickelt. Anschließend wurde mit Hilfe dieser Methode die Bindung von TrmBL1 unter glycolytischen und gluconeogenetischen Bedingungen genauer analysiert. Unter gluconeogenetischen Bedingungen konnten 22 Bindestellen ermittelt werden. Bei allen Positionen konnte das TGM Motiv nachgewiesen werden. Die meisten der über ChIP-Seq identifizierten Bindestellen waren bis auf einige Ausnahmen bereits aus vorhergehenden Arbeiten bekannt. Mit Hilfe dieser Daten konnte der postulierte Regulationsmechanismus für TrmBL1 erstmals in vivo bestätigt werden. Bei der Sequenzierung der ChIP-Seq-Ansätze hat sich gezeigt, dass in allen analysierten Proben ein 16 kB Fragment im Genom des verwendeten Pyrococcus Stammes deletiert ist, welches u. a. das Trehalose/Maltose Operon inklusive des Regulators TrmB enthält. Versuche mit einem neu von der DSMZ angeforderten Pyrococcus Stamm haben gezeigt, dass dieses Fragment unter verschiedenen Kulturbedingungen nicht stabil im Genom erhalten bleibt. Um die Funktion von TrmBL2 zu ermitteln, wurde eine Deletionsmutante erstellt. Da vergleichende Wachstums- und Genexpressionsanalysen des Wildtyps und der Deletionsmutante keine Hinweise auf eine mögliche Funktion ergeben haben, wurde auch für TrmBL2 ein ChIP-Seq-Experiment durchgeführt. Insgesamt konnten 263 Bindestellen identifiziert werden, die sowohl unter glycolytischen als auch unter gluconeogenetischen Bedingungen nachgewiesen werden konnten. Es war allerdings nicht möglich, aus den identifizierten Bindestellen eine Konsensussequenz zu ermitteln. Anhand von in vitro Transkriptionsexperimenten mit zwei unterschiedlichen Matrizen konnte der Nachweis erbracht werden, dass die Expression von TrmBL2 sehr wahrscheinlich durch negative Autoregulation kontrolliert wird. Die Verteilung der Bindestellen deutet darauf hin, dass es sich bei TrmBL2 um ein Chromatin-bindendes Protein handelt. Die genaue Funktion konnte bisher allerdings noch nicht ermittelt werden. Eventuell spielt es eine Rolle bei der Hitzeschock-Antwort.
Publications
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Shuttle vector-based transformation system for Pyrococcus furiosus. Appl. Environ. Microbiol. 76, 3308-3313 (2010)
Waege, I., Schmid, G., Thumann, S., Thomm, M., und Hausner, W.
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Genetic engineering of Pyrococcus furiosus to use chitin as a carbon source. BMC Biotechnol. 13 (2013)
Kreuzer, M., Schmutzler, K., Waege, I., Thomm, M., und Hausner, W.
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Activation of a chimeric Rpb5/RpoH subunit using library selection. PLOS ONE 29, e87485 (2014)
Sommer, B., Waege, I., Pöllmann, D., Seitz, T., Thomm, M., Sterner, R., und Hausner, W.
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Charakterisierung von RNA-Polymerase-Mutanten und von Transkriptionsfaktoren mit Hilfe des genetischen Systems von Pyrococcus furiosus. Dissertation, Universität Regensburg 2014
Ingrid Waege
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The TrmB family – a versatile group of transcriptional regulators in Archaea. Extremophiles
Gindner, A., Hausner, W., Thomm, M.
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Analysis of Gene Reguatory Networks in Pyrococcus furiosus by ChIP-seq. Dissertation, Universität Regensburg 2015. V, 130 S.
Robert Reichelt
