Beiträge der T1R2 & T1R3 Untereinheiten des Süßgeschmacksrezeptors zur Detektion von Saccharin und Brazzein
Final Report Abstract
Seine angeborene Vorliebe für süße Geschmacksreize hat wohl während der Evolution des Menschen sein Überleben gesichert, da sie energiereiche, kohlenhydratreiche Nahrungsquellen erkennen lässt. In der heutigen Überflussgesellschaft trägt diese Vorliebe jedoch zur endemischen Prävalenz von Übergewicht und Adipositas bei. Süß schmeckende Substanzen werden durch einen Doppelrezeptor (sog. Dimer) detektiert. Die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) T1R2 und T1R3 bilden zusammen ein funktionelles Dimer, welches sowohl den reinen Süßgeschmack natürlicher Zucker, als auch den intensiven, teils komplexen Süßeindruck kalorienfreier synthetischer Süßstoffe vermittelt. Mit Hilfe biochemischer und Zell-basierter Methoden zielt unser Projekt zur Aufklärung des Beitrags jeder dieser Süßrezeptoruntereinheiten zur Bindung zweier extrem verschiedener Substanzen: dem niedermolekularen synthetischen Saccharin, und dem vergleichsweise großen pflanzlichen Süßprotein Brazzein. Das pflanzliche Peptid Gurmarin, welches selektiv die Süßwahrnehmung in Ratten blockiert, ist ein weiterer Gegenstand unseres Süßrezeptorprojekts. Polymorphismen im murinen T1r3 Gen deuteten auf eine Rolle dieser Untereinheit für die Sensitivität des Süßrezeptors gegenüber Saccharin hin. Biophysikalische Untersuchungen unseres Kooperationspartners Loic Briand erwiesen jedoch, dass das Sulfonylamid durch die aminoterminalen Domänen (NTD) beider Untereinheiten, T1R2 und T1R3, gebunden wird. Die Analyse dieser Bereiche durch funktionelle Expression mutierter Rezeptoruntereinheiten ergab, dass Saccharin mit T1R2 und T1R3 über Aminosäurereste in deren orthosterischen Bindungsstellen interagiert. Korrespondierende Reste wurden bereits als Ligandenbindungsstellen in verwandten Klasse C GPCRs, wie z.B. metabotropen Glutamatrezeptoren, beschrieben. Die Saccharin-Bindungsstelle in T1R2 überlappt teilweise mit der des niedermolekularen Süßstoffs Sucralose, was auf die Existenz mehrerer Bindungsstellen in den NTDs von T1Rs hindeutet. Das pflanzliche Protein Brazzein wird nur von Menschen und Altweltaffen als süß wahrgenommen. Vorangegangene Studien, welche sich diese Speziesunterschiede zu Nutze machten, wiesen auf eine Rolle der cysteinreichen Region (CRD) des humanen T1R3 für die Sensitivität gegenüber Brazzein hin. Eine zusätzliche Beteiligung der hT1R2-Untereinheit blieb jedoch nicht ausgeschlossen. Wir konnten zeigen, dass neben den CRDs auch die NTDs der Untereinheiten obligatorisch für die Reaktion des Süßrezeptors auf rekombinantes Brazzein sind. Die genaue Identität der Brazzein-Bindungsstelle bleibt jedoch ungeklärt, da unsere Mutationsanalysen weder eine Beteiligung der orthosterischen Bindungstaschen, noch von sog. „Wedge Modell“-Resten, einer hypothetischen Bindungsstelle für hochmolekulare Agonisten an der Grenzfläche zwischen den NTDs von T1R2 und T1R3, nahelegen. Das pflanzliche Peptid Gurmarin ist ein selektiver Inhibitor der murinen Süßgeschmackswahrnehmung. Unsere zell-basierten Experimente ergaben, dass rekombinant erzeugtes Gurmarin direkt am murinen Süßgeschmacksrezeptor, via der NTD des rT1r3, wirkt. Gurmarin blockierte wie in Tierexperimenten beschrieben, die Reaktion rT1r2/r3-exprimierender Zellen auf Süßstoffe umfassend und langanhaltend, jedoch reversibel. Rekombinant erzeugte Gurmarin-Mutanten wiesen auf die Bedeutung eines Clusters aus Seitenketten hydrophober Aminosäuren an der Oberfläche des Moleküls für die inhibierenden Eigenschaften des Peptids hin. Die Bindungsstelle für Gurmarin am Rezeptorprotein, sowie sein Wirkmechanismus bleiben jedoch aufzuklären. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, welche der Detektion süßer Substanzen durch Süßgeschmacksrezeptoren zu Grunde liegen, sind Voraussetzung für die Entwicklung geschmackoptimierter kalorienfreier Süßstoffe, Süßgeschmacksverstärker und –inhibitoren. In diesem Sinne leistet unser Projekt einen Beitrag zur Bekämpfung von Übergewicht und ist daher auch von öffentlichem Interesse.
Publications
-
Efficient production and characterization of the sweet-tasting brazzein secreted by the yeast Pichia pastoris. J Agric Food Chem. 2012; 60(39):9807-14
Poirier N, Roudnitzky N, Brockhoff A, Belloir C, Maison M, Thomas- Danguin T, Meyerhof W, Briand L
-
Heterologous overexpression of functional gurmarin, a sweet-taste-suppressing protein, by the methylotrophic yeast Pichia pastoris. XVI International symposium on Olfaction and Taste. 23-27 june 2012, Stockholm, Sweden
Sigoillot M, Brockhoff A, Lescop E, Poirier N, Meyerhof W, Briand L
-
Optimization of the production of gurmarin, a sweet-taste-suppressing protein, secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol. 2012A; 96(5):1253-63
Sigoillot M, Brockhoff A, Lescop E, Poirier N, Meyerhof W, Briand L
-
Sweet-taste-suppressing compounds: current knowledge and perspectives of application. Appl Microbiol Biotechnol. 2012B; 96(3):619-30
Sigoillot M, Brockhoff A, Meyerhof W, Briand L
