Phospholamban-Pentamere: Struktur, Phosphorylierung und Pathogenität
Final Report Abstract
Im Projekt "Phospholamban-Pentamere: Struktur, Phosphorylierung und Pathogenität" wurden die physiologischen Mechanismen der Phospholamban (PLN)-Regulation untersucht. PLN liegt im Herzen zu etwa 25% als Monomer und 75% als Pentamer vor. Während PLN-Monomere durch Bindung und Hemmung der Ca2+ -ATPase SERCA2a die Kinetik der Ca2+ -Aufnahme in die intrazellulären Speicher der Herzmuskelzellen regulieren und dadurch die diastolische Relaxation des Myokards steuern, war die Funktion der Pentamere bislang völlig unklar. Vorarbeiten des Projektleiters hatten einen ersten Hinweis gegeben, dass PLN-Pentamere für die PKA- abhängige Phosphorylierung von PLN und damit für die Regulation der PLN-Aktivität bedeutsam sein könnten. Eine Punktmutation im PLN (PLNR9C), die in Mensch und Maus zu terminaler Herzinsuffizienz führt, konnte nämlich die Phosphorylierung von Wildtyp-PLN im heterozygoten Organismus nur innerhalb der Pentamere verhindern. Im Rahmen dieses Projekts wurde zunächst die funktionelle Bedeutung dieses Befundes untersucht. Transgene Mäuse, in denen PLNR9C ausschließlich als Monomer vorlag, zeigten im Vergleich zu Tieren, die PLNR9C auch in PLN-Pentameren exprimierten, eine stärkere PLN-Phosphorylierung, sie erkrankten erst deutlich später und schwächer an Herzinsuffizienz und lebten etwa dreimal länger. Der zugrundeliegende Mechanismus wurde mit Hilfe von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) geklärt. Die FRET-Untersuchungen ergaben nämlich, dass die PLN R9C-Mutation die Struktur der Pentamere in den zytosolischen Abschnitten deutlich verändert, wodurch die Interaktion aller Protomere (PLNR9C und Wildtyp-PLN) mit der PKA beeinträchtigt und dadurch die PLN-Phosphorylierung reduziert würde. Da dieser dominante Phosphorylierungsdefekt der PLNR9C-Mutation die Bildung von Pentameren voraussetzte, wurde im zweiten Teil des Projekts die Hypothese verfolgt, dass die Pentamerbildung von grundsätzlicher Bedeutung für die PLN-Phosphorylierung und damit für die Regulation der PLN-Aktivität ist. Untersuchungen an transfizierten HEK293-Zellen sowie an neu generierten transgenen Mausmodellen ergaben, dass PLN-Pentamere direkte und bevorzugte Zielstrukturen der PKA darstellen. Die PKA zeigte eine höhere Affinität zu PLN-Pentameren als zu PLN-Monomeren, was zu einer sensitiveren und schnelleren Phosphorylierung der Pentamere führte. Die Phosphorylierung der Pentamere erfolgte dabei stufenweise, wobei stets auch Pentamere mit unphosphorylierten Protomeren vorlagen. Dadurch würde erklärt, warum in Co-Immunpräzipitations-Experimenten die PLN-Pentamere selbst nach intensiver PKA-Stimulation mit der SERCA2a in Kontakt blieben, während die Monomere vollständig abdissoziierten und dadurch ihre inhibitorische Wirkung auf die SERCA2a verloren. Ein weiterer und zentraler Befund war die Feststellung, dass PLN-Pentamere die Phosphorylierung von PLN-Monomeren abschwächen. Dadurch wurde die Monomer-Phosphorylierung basal verringert und nach PKA-Stimulation verzögert. Die Folge war eine höhrere Aktivität der PLN-Monomere in Anwesenheit von Pentameren. In neu generierten transgenen Mausmodellen mit und ohne PLN-Pentameren äußerte sich dies in erweiterten Möglichkeiten zur PKA-abhängigen Regulation der diastolischen Herz-Relaxation. Die Mäuse konnten dadurch kardialen Stress in Form einer chronischen Druckbelastung des linken Ventrikels nach Konstriktion der Aorta transversa (TAC) besser kompensieren als Mäuse ohne PLN-Pentamere wie sich an einem niedrigeren Herzgewicht, einer besseren Herzfunktion und einer geringeren Sterblichkeit zeigte. Zusammenfassend ist der identifizierte regulatorische Mechanismus der PLN-Pentamere für die Phosphorylierung und Aktivität der PLN-Monomere im nachfolgenden Modell veranschaulicht.
Publications
- Cardiac fibrosis in mice with hypertrophic cardiomyopathy is mediated by non-myocyte proliferation and requires Tgf-beta. J Clin Invest. 120:3520-3529, (2010)
Teekakirikul P, Eminaga S, Toka O, Alcalai R, Wang L, Wakimoto H, Nayor M, Konno T, Gorham JM, Wolf CM, Kim JB, Schmitt JP, Molkentin JD, Norris RA, Tager AM, Hoffman SR, Markwald RR, Seidman CE, Seidman JG
(See online at https://doi.org/10.1172/JCI42028) - Generation and characterization of monomeric phospholamban mutants. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 383:S28 (2011)
Wittmann T, Lorenz K, Lohse MJ, Schmitt JP
- Oligomerization is important for regulation of phospholamban activity. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 385:S105 (2012)
Wittmann T, Lohse MJ, Schmitt JP
- The pentameric form of phospholamban is an important PKA target. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 386:S92 (2013)
Wittmann T, Lohse MJ, Schmitt JP
- The pentameric form of phospholamban is important for the regulation of phospholamban phosphorylation and function. Circulation. 128;22 (2013)
Wittmann T, Lohse MJ, Schmitt JP
- Phospholamban monomers are more active in the presence of pentamers. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 387:S18 (2014)
Wittmann T, Lohse MJ, Schmitt JP
- β-Myosin Heavy Chain Variant Val606Met Causes Very Mild Hypertrophic Cardiomyopathy in Mice, but Exacerbates HCM Phenotypes in Mice Carrying Other HCM Mutations, Circ Res. 115: 227-237 (2014)
Blankenburg R, Hackert K, Wurster S, Deenen R, Seidman JG, Seidman C, Lohse MJ, Schmitt JP
(See online at https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.115.303178) - Phospholamban pentamers attenuate PKA-dependent phosphorylation of monomers. J Mol Cell Cardiol. 80: 90-97 (2015)
Wittmann T, Lohse MJ, Schmitt JP
(See online at https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2014.12.020)
