Licht-induzierte Strukturänderungen in den Photorezeptoren PYP, Cph1 und Agp1 mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Photorezeptoren sind Signal-Proteinen die ein Lichtsignal mittels einer sogenannten Chromophor absorbieren. Die Anregung führt zunächst zu einer kleinen Änderung in der Struktur des Chromopors. Nach einiger Zeit (Milli-Sekunden) induziert diese strukturelle Störung in der Chromphor Bindungs Tasche aber einen globalen Struktur Änderung im ganzen Protein in den der Chromophor eingebettet ist. Der strukturell geänderte Photorezeptor ist nun in der sogenannte „active or signaling state“ und kann jetzt von weiteren Proteinen, sogenannte „response regulators“, erkannt werden. Auf diese Weise wird das Signal weitergeleitet. In diesem Projekt wurden die licht-induzierte Aktivierungs-Schritten in den bakteriellen Photorezeptoren PYP und LOV2 sowie das Sehpigment Rhodopsin aus Rinderaugen untersucht. Als Messsignal wurde dabei die Fluoreszenz gewählt. Von den Aminosäuren die ein Protein bilden fluoresziert nur das Tryptophan. PYP enthält nur ein Tryptophan, sodass ortsspezifische Information gewonnen werden kann. LOV2 enthält zwei Tryptophane, Rhodopsin fünf. Ausser der nativen Fluoreszenz wurden fluoreszierende Marker Gruppen an spezifische Stellen mittels Cystein Mutanten eingebaut. Ändert ein Protein seine Struktur führt dies in der Regel zu Änderungen der Fluoreszenz, entweder da die fluoreszierende Gruppe eine Umgebungs-Änderung erfährt oder da seine Fluoreszenz mehr oder weniger durch Energie Transfer gelöscht wird. Die Änderungen der Fluoreszenz wurden nach Blitz Anregung der Proteine über einen sehr großen Zeitskala (von ns bis Sekunden) zeitlich verfolgt. Auf diese Weise erhält man Information wann die Änderungen stattfinden und auch wo (Ortsspezifität). Diese sogenannte transiente Fluoreszenz wurde hier erstmals bei Photorezeptoren, die sich durch einen Lichtblitz leicht synchronisieren lassen, erfolgreich eingesetzt. Exemplarisch für die Ergebnisse haben wir Folgendes gelernt. Bei Rhodopsin konnten wir zeigen, dass in ihre natürliche Umgebung, die Struktur Änderung des Proteins der Protonen Aufnahme voran geht. Bei PYP konnten wir ein Weg aufzeigen wie sich sie strukturelle Störung durch das Protein ausbreitet. Die transiente Fluoreszenz hat als kinetische Methode eine große Zukunft wegen seinen hohen Empfindlichkeit und Ortsspezifizität.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Role of a conserved salt bridge between the PAS core and the N-terminal domain in the activation of the photoreceptor photoactive yellow protein. Biophysical Journal 2007, 93, 1687-1699
D. Hoersch, H. Otto, C.P. Joshi, B. orucki, M.A. Cusanovich and M.P. Heyn
- Distinguishing chromophore structures of photocycle intermediates of the photoreceptor PYP by transient fluorescence and energy transfer. Journal of Physical Chemistry B 2008, 112, 9118-9125
D. Hoersch, H. Otto, M.A. Cusanovich and M.P. Heyn
- Monitoring the conformational changes of photoactivated rhodopsin from microseconds to seconds by transient fluorescence spectroscopy. Biochemistry 2008, 47, 11518-11527
D. Hoersch, H. Otto, I. Wallat, and M.P. Heyn
- Monitoring light-induced conformational changes in photoreceptors by time –resolved spectroscopy. Dissertation, Fachbereich Physik, Freie Universität Berlin, Mai 2009
Daniel Hoersch
- Strong hydrogen bond between glutamic acid 46 and chromophore leads to the intermediate spectral form and excited state proton transfer in the Y42F mutant of the photoreceptor photoactive yellow protein. Biochemistry 2009, 48, 9980-9993
C.P. Joshi, H. Otto, D. Hoersch, T.E. Meyer. M.A. Cusanovich and M.P. Heyn
- Time-resolved spectroscopy of dye-labeled PYP suggests a pathway of lightinduced structural changes in the N-terminal cap. Physical Chemistry Chemical Physics 2009, 11, 5437-5444
D. Hoersch, H. Otto, M.A. Cusanovich and M.P. Heyn
- Dynamics of light-induced activation in the PAS domain proteins LOV2 and PYP probed by time-resolved tryptophan fluorescence. Biochemistry 2010, 49, 10811-10817
D. Hoersch, F. Bolourchian, H. Otto, R.A. Bogomolni and M.P. Heyn
