Das Problem der Hox-Spezifität angehen: Entschlüsselung der DNA-Bindungs- und Proteininteraktionseigenschaften von CRISPR-entwickelten Hox-Chimären

• Antragstellerin: Professorin Dr. Ingrid Lohmann
• Fachliche Zuordnung: Entwicklungsbiologie ; Allgemeine Genetik und funktionelle Genomforschung
• Förderung: Förderung seit 2010
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 158148543

Hox-Proteine, bekannt für ihre konservierte Homöodomäne, beeinflussen die Entwicklung, indem sie Segmentidentitäten entlang der anterior-posterioren Achse definieren. Trotz ihrer nuancierten In-vivo-Funktionen zeigen Hox-Transkriptionsfaktoren (TFs) in vitro ähnliche DNA-Bindungspräferenzen, was zum Hox-Paradoxon führt. Während einige Aspekte dieses Phänomens geklärt sind, bleibt unklar, warum eng verwandte Hox-Proteine unterschiedliche Transkriptionsprofile aufweisen und welche Mechanismen diese Spezifität bestimmen. Wir haben gezeigt, dass das anteriore Hox-Protein Deformed (Dfd) sein Zielgen AP-2 über einen Dfd-spezifischen Enhancer aktiviert, während das verwandte Sex combs reduced (Scr) dies nicht kann. Mit Dfd und Scr als Modellen untersuchen wir nun ihre DNA-Bindungsaffinität, Transkriptionsaktivität und Protein-Interaktionen im physiologischen Kontext. Insbesondere analysieren wir die Rolle der Homöodomäne bei der Spezifitätsvermittlung durch Vergleich mit chimären Dfd- und Scr-Proteinen. Mithilfe von CRISPR-editierter Genommodifikation ersetzen wir die gesamte Homöodomäne von Dfd oder Scr durch die des jeweils anderen Gens, um Dfd-ScrHD- und Scr-DfdHD-Chimären zu erzeugen. Diese Strategie stellt sicher, dass die Proteinvarianten in Embryonen mit den räumlich-zeitlichen und quantitativen Charakteristika der Wildtyp-Hox-Proteine exprimiert werden. Dies ist entscheidend, da frühere Fehlexperimente mit chimären Hox-Proteinen oft zu künstlich hohen TF-Expressionsniveaus führten. Darüber hinaus setzen wir UltraID (proximity-dependent labeling) ein, um neue Interaktionspartner von Dfd und Scr zu identifizieren und die zugrunde liegenden Mechanismen funktioneller Spezifität aufzuklären. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen wollen wir den AP2-377-Enhancer so modifizieren, dass er Scr-Spezifität erhält. Dies erreichen wir durch gezielte Veränderungen von Hox- und Kofaktor-DNA-Bindungsmotiven auf Basis unserer experimentellen Daten. Diese Studie liefert einen neuen Einblick in die präzise Genregulation durch verwandte Hox-Proteine im zellulären Kontext. Zudem trägt sie dazu bei, die evolutionären Konsequenzen genetischer Reorganisation und Domänenaustauschs innerhalb von TFs besser zu verstehen. Damit besitzt sie das Potenzial, unser Wissen über Genregulation und Entwicklungsbiologie grundlegend zu erweitern – mit weitreichenden Implikationen für die Grundlagen- und angewandte Forschung.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen