Markierungsfreier Proteinarray zur kinetischen Analyse von Autoantikörpern beim Antiphospholipid-Syndrom
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Der Nachweis einer großen Zahl serologischer Parameter kann für eine differenzierte Diagnose und eine abgestimmte, personalisierte Therapie von großem Vorteil sein. Die Erforschung von parallelisierten, klinisch relevanten Tests erlaubt Multiplex-Bestimmung, ohne dabei mehr Patientenmaterial zu verbrauchen, höhere Kosten zu verursachen oder mehr Zeit zu benötigen. Im Rahmen einer Kooperation zwischen der Eberhard Karls Universität Tübingen und der Technischen Universität München war es das Ziel, eine neue, parallelisierte optische Transduktionsmethode für Proteinmicroarrays zu untersuchen und zu charakterisieren. Dabei stand zunächst im Vordergrund die geeigneten optischen Parameter in Bezug auf Wellenlänge und Polarisation der Lichtquelle, sowie den optimalen Einfallswinkel auf die Sensoroberfläche zu ermitteln. In Tübingen wurden diese Parameter vor dem experimentellen Aufbau der Sensorplattform durch theoretische Berechnungen der zu erwarteten Signalintensität bei einer biomolekularen Wechselwirkung unter verschiedenen Beleuchtungsszenarien simuliert. Mit in diese Berechnungen eingeschlossen wurde der Aufbau des verwendeten Transducersubstrats, auf das in einem späteren Schritt die sensitiven Schichten aufgebracht wurden. Der optische Teil der in diesem Projekt realisierten experimentellen n Sensorplattform wurde mehrheitlich durch kommerziell verfügbare Komponenten realisiert, wohingegen für den fluidischen Teil des Messsystems verschiedene Flusszellenhalterungen eigens entworfen wurden. Diese Messsanordnung ermöglichte die experimentelle Bestätigung der theoretischen Überlegungen und der simulierten Datensätze zum Einfluss der optischen Parameter auf das Messsignal. Durch die Erforschung neuartiger Oberflächenmodifikationen der Transducersubstrate konnte ein Microarray der wichtigsten APS-Antigene etabliert und damit die generelle Performance des Messsystems in Verbindung mit der untersuchten Oberflächenchemie bestimmt werden. Dazu etablierte die Münchener Arbeitsgruppe eine geeignete Oberflächenchemie für den Microarray-Glaschip. Zur Optimierung der Biokonjugation wurde in München dabei ein 1-λ-Reflektometrie-Sensor aufgebaut. Für den pi-RIfS-Microarray in Tübingen mussten die Serumproben aufgereinigt werden. Dieser zusätzliche Arbeitsschritt ermöglichte schließlich den simultanen Nachweis mehrerer Antikörper unter identischen Analyse-Bedingungen, eine Voraussetzung für ein funktionierendes Array-System. Im folgenden Schritt wurden die gewonnenen Erkenntnisse auf Messungen mit realen Patientenproben angewandt und Messreihen mit einer großen Anzahl von Patienten- und Referenzproben durchgeführt. Mit 35 APS-Patienten, 6 SLE- und 24 gesunden Kontrollen konnte für den Nachweis von antiβ2-GPI und anti-Prothrombin eine hervorragende Sensitivität und Spezifität gezeigt werden. Für die Bestimmung von anti-CL und anti-β2-GPI/CL-Komplex lieferte der Biosensor zufriedenstellende Werte. Es konnte eine gute Übereinstimmung der Ergebnisse von Immunoassay-Tests mit dem experimentellen, parallelisierten optischen Messaufbau festgestellt werden. Ein großer Vorteil der verwendeten innovativen Messtechnik gegenüber zahlreichen etablierten Methoden ist die Möglichkeit kinetische Ratenkonstanten der biomolekularen Wechselwirkung zu bestimmen und daraus einen tieferen Einblick in die Art der Wechselwirkung zu erhalten. Mit Hilfe des parallelisierten Messaufbaus konnte dies anhand der Modellantikörper gezeigt werden. Eine im Projekt entworfene temperierbare Flusszellenhalterung erlaubte es dabei für definierte Rahmenbedingungen bei der Messtemperatur zu sorgen, um auch zukünftig Temperatureinflüsse, sowie Anteil von Enthalpie und Entropie bei der biomolekularen Interaktionsanalyse zu erforschen. Dieser außerordentliche Vorteil der hier erforschten Systeme für die serologische Diagnostik des APS, eröffnet zusätzliche Möglichkeiten in der Untersuchung der spezifischen APL-Antigen-Wechselwirkungen. Die mit dem pi-RIfS-Array erzielten Pilotergebnisse lassen darauf schließen, dass ein „diagnostisches Profiling“ der humoralen Immunantwort bei APS möglich werden wird. Es bleibt den weiteren Arbeiten nach Ende der Laufzeit des Projektes vorbehalten, die Frage zu klären, inwieweit sich durch den Einfluss von Affinität bzw. Avidität der Auto-AK auf die erhaltenen Sensorgramme Aussagen zum pathogenen Potential der APL treffen lassen. Dies würde für die serologische Diagnostik des APS einen deutlichen Erkenntnisgewinn bringen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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(2012) Glass Chip Development for Microarray Measurements of Antiphospholipid Antibodies Using Reflectometric Interference Spectroscopy (RIfS). (American Association of Clinical Chemistry, Annual Meeting 2012, Los Angeles, CA)
Schindler, A., Schlichtiger, A., Bleher, O., Proll, G. and Luppa, P. B.
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A new parallelized label-free optical biosensor setup – the polarized imaging Reflectometric Interference Sensor. (analytica 2012, München)
O. Bleher, F.Pröll, A. Schindler, G. Proll, P. Luppa, G. Gauglitz
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The polarized imaging Reflectometric Interference Sensor - A new parallelized label-free optical biosensor setup. (Label-free Technologies 2012, Amsterdam)
O. Bleher, F.Pröll, A. Schindler, G. Gauglitz, P. Luppa, G. Proll
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Development of a new parallelized, optical biosensor platform for label-free detection of auto-immunityrelated antibodies. Anal Bioanal Chem. 2013 Nov 27 [Epub ahead of print]
Bleher O, Schindler A, Yin MX, Holmes AB, Luppa PB, Gauglitz G, Proll G
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Diagnostic performance study of a label-free microarray for the detection of antiphospholipid antibodies. Send to
Clin Chem Lab Med. 2015 Apr;53(5):801-8
Schindler A, Bleher O, Kocot C, Proll G, Gauglitz G, Luppa PB
