Beeinflussung der zellullären Signaltransduktionswege nach Infektion mit dem nichtcytopathogenen Bovinen Virusdiarrhoe Virus
Final Report Abstract
Die erfolgreiche Etablierung einer Virusinfektion erfordert die zielgerichtete Umgehung der Abwehrmechanismen des Wirtsorganismus. Ein wichtiger Aspekt ist hierbei die Modulation der zellulären Signalwege. Das Bovine Virusdiarrhoe Virus (BVDV) zählt innerhalb der Familie Flaviviridae zum Genus Pestivirus und scheint das wirtseigene Kommunikationssystem auf vielfältige Weise zu beeinflussen. Neben einer Einteilung in die Spezies BVDV-1 und -2 erfolgt eine Unterscheidung anhand des Verhaltens in einer permissiven Zellkultur in einen cytopathogenen (cp) und einen nichtcytopathogenen (ncp) Biotyp. Der Erfolg des Virus basiert u.a. auf der Strategie des ncp BVDV abhängig vom Alter und Immunstatus des Wirts eine persistente Infektion hervorzurufen zu können. Die molekularen Mechanismen, welche die Etablierung einer Viruspersistenz begünstigen, sind bisher nur unzureichend geklärt. Die gezielte Modulation zellulärer Signalwege ist jedoch wahrscheinlich. Erstes Ziel dieses Projektes war es daher zu klären, welche zellulären Signalwege von der BVDV-Infektion beeinflusst werden, und welche biotypspezifischen Unterschiede erkennbar sind. Besonderes Augenmerk lag auf der Analyse der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK) sowie des PI3-K/Akt-Signalkaskade, die in eine Vielzahl sowohl pro- als auch antiapoptotischer Prozesse involviert sind. Im Gegensatz zu cp BVDV scheint der ncp Biotyp eine Tarnkappe zu tragen. Unabhängig von der Adaptation an Zellkulturbedingungen und der verwendeten Zelllinie wurde keine signifkante Aktivierung der antiaopoptotisch wirksamen Signalwege ERK1/2-MAPK oder Akt/PI3K nachgewiesen. Auch die durch Stress induzierbaren Kinasen p38 MAPK und SAPK/JNK wurden lediglich nach Infektion mit cp BVDV aktiviert. Die gezielte Inhibition einzelner Kaskaden zeigte, dass lediglich die Blockade der p38 MAPK die Virusreplikation und –ausbreitung sowie das Auftreten des durch cp BVDV-induzierten cytopathischen Effektes verzögern kann. Eine vollständige Inhibition, wie sie für die Caspasenkaskade gezeigt wurde, wurde jedoch nicht erreicht. Verschiedene Proteine des BVDV modulieren die Wirtszellantwort. Die Rolle des Phosphoproteins NS5A ist im Vergleich zum homologen Protein des verwandten Hepatitis C Virus (HCV) diesbezüglich bisher nur unzureichend geklärt. Daher sollte im zweiten Teil des Projektes, die Funktion des NS5A im Verlauf der BVDV-Infektion analysiert und sein Einfluss auf die zellulären Signalwege geklärt werden. Die für die Untersuchungen notwendige Herstellung spezifischer Antikörper mit Hilfe bakteriell exprimierter Proteine gelang jedoch nicht, so dass alternative Strategien herangezogen werden mussten, um das Protein zu charakterisieren. Die Analyse der Primärstruktur von insgesamt 42 Pestiviren bestätigte die Vermutung, dass das NS5A sehr heterogen ist und Identitäten von lediglich 56% bis 94% aufweist (BVDV-1: 82 – 94%). Biotypspezifische Unterschiede oder Mutationen bedingt durch die Adapation an Zellkulturen waren nicht erkennbar. Auf Grund der im Vergleich zu HCV deutlich geringeren Anzahl möglicher Phosphorylierungsstellen und dem Fehlen der für HCV-NS5A postulierten Domänen kann über eine Übertragung der Funktionen auf das BVDV-NS5A nur spekuliert werden. Die alleinige Expression des BVDV-NS5A, an das entweder das enhanced green fluorescent protein oder ein FLAG-Epitop fusioniert worden war, war überwiegend mit dem endoplasmatischen Reticulum (ER) assoziiert. Die Position des Fusionspartners beeinflusste die Expressionsrate signifikant. Lediglich N-terminale Additionen führten zu maximalen Expressionsraten, während die C-terminale Addition eine Expression drastisch reduzierte bzw. abhängig von der Zelllinie sogar vollständig inhibierte. Sukzessive Deletionen des C-Terminus steigerten die Expression. Interessanterweise ging die Expression verkürzter NS5AProteine mit einer vermehrten Vesikelbildung im Cytoplasma einher. Es bleibt zu klären, ob es sich um eine spezifische Assoziation viraler Proteinkomplexe mit Bestandteilen zellulärer Organellen handelt, die evtl. für die Replikation von Bedeutung sind. Die Verfügbarkeit kreuzreaktiver Antikörper gegen verschiedene Komponenten der Signaltransduktionskaskaden sowie spezifischer Antikörper gegen das Phosphoprotein NS5A ist zwingend erforderlich, um die einzigartigen Mechanismen verstehen zu können, die zur Persistenz des BVDV führen.
Publications
- BENDFELDT, S., B. GRUMMER, L.-E. BURKHARDT, I. GROTHA, I. GREISER-WILKE (2007): The nonstructural protein 5A of Bovine viral diarrhea virus (BVDV) -still a riddle" Third European Congress of Virology in Nürnberg
- BENDFELDT, S., B. GRUMMER, L.-E. BURKHARDT, I. GROTHA, I. GREISER-WILKE (2008): The nonstructural protein 5A of Bovine viral diarrhea virus ¿ a still unknown regulator" Seventh Pestivirus Symposium in Uppsala, Sweden
- BENDFELDT, S., K. PANNHORST, I. GROTHA, J.D. NEILL, B. GRUMMER, V. MOENNIG, I. GREISER-WILKE (2007): "Modulation of cellular signaling pathways after infection with noncytopathic Bovine viral diarrhea virus", 26th Annual Meeting American Society for Virology in Corvallis, USA
- PANNHORST, K., B. GRUMMER, I. GREISER-WILKE, S. BENDFELDT (2007): "Infection with noncytopathic Bovine viral diarrhea virus (BVDV) does not induce stress-activated protein kinase pathways", Third European Congress of Virology in Nürnberg
