Mapping nuclear pore surface with atomic force microscopy
Final Report Abstract
Ziel der Forschungsarbeit war es, neue Einsichten in die Struktur und die Funktion der Kernporenoberfläche als Vermittlerin des Transportes in den Zellkern zu gewinnen. Als Modell-System dienten die Oozyten des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis. Der Kern dieser großen Zellen (~1.2 mm im Durchmesser) lässt sich leicht isolieren und beide Seiten der Kernhülle lassen sich für strukturelle Untersuchungen auf einer Glassoberfläche ausbreiten. Wir haben zunächst mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie und elektrophysiologischer Methoden den Transport von Ionen und anderen kleinen Molekülen in den Kern untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass es für diese kleinen Moleküle einen Transportweg gibt, welcher separat vom zentralen Kanal der Kernporen in deren Peripherie verläuft. Der zentrale Kanal ist im Wesentlichen dem aktiven Rezeptor-vermittelten Transport vorbehalten. Gezeigt wurde dies unter anderem dadurch, dass die Blockade des zentralen Kanals mit einem mutierten Transportfaktor (Importin β 45-462) keinen Einfluss auf die Permeabilität der Kernporen für Ionen und andere kleine Moleküle hat. Damit gelang zum ersten Mal die funktionelle Trennung der zwei wesentlichen Transportrouten in den Zellkern. Durch einen methodisch-neuen Ansatz, nämlich der Kombination elektrischer Messungen mit AFM-Techniken, konnten wir zwischen dem Transportweg durch periphere kleine Poren des Kernporenrings und der Route durch den großen zentralen Kanal unterscheiden. In einem weiteren experimentellen Ansatz untersuchten wir die strukturellen Änderungen der Kernhülle während der Apoptose, einer Form des programmierten Zelltodes. Wir gingen davon aus daß sich die Oberflächeneigenschaften der Kernporen dabei verändern und dadurch den Transport der Makromoleküle steuern. Tatsächlich konnte mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie gezeigt werden, dass bestimmte Komponenten der Kernporen, welche für den Rezeptor-vermittelten Transport von essentieller Bedeutung sind, früh während der Apoptose abgebaut werden. Dazu gehören die Korbstruktur auf der Innenseite der Kernhülle und die Oberflächenfilamente auf der Außenseite. Weiters konnten wir mittels AFM Änderungen der mechanischen Eigenschaften der Kernhülle während der Apoptose messen. Es konnte gezeigt werden, dass die Kernhülle in Folge des Abbaus der Lamina, einer filamentösen Schicht an der Innenseite des Zellkernes, weicher wird. Dieses Aufweichen der Kernhülle ist möglicherweise in späteren Phasen der Apoptose für die Bildung von Mikrokernen von Bedeutung.
Publications
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