Korrektur des genetischen Defektes mittels Zinkfingernukleasen (ZFN) bei der GM1-Gangliosidose des Alaskan Husky
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Rahmen vorausgehender Studien wurde gezeigt, dass die Ursache der GM1-Gangliosidose beim Alaskan Husky in einer 19bp Duplikation innerhalb des Exon 15 (Exon 15 mut) der kaninen sauren β-Galaktosidase (GLB1) liegt. Die Zielsetzung des geförderten Projektes bestand daher in der Beurteilung der therapeutischen Validität eines gentherapeutischen Ansatzes mittels einer Zinkfingernuklease (ZFN)-basierten Wiederherstellung des Wildtyp β-Galaktosidase-Gens. Die zu diesem Zweck konstruierten Zinkfingernukleasen wurden in Vorarbeiten zum Antrag auf Minigenen getestet und zeigten hier eine spezifische Doppelstrangbruch (DSB)-Induktion am Targetlokus. In dem geförderten Projekt wurde im ersten Schritt die Funktionalität der Nukleasen im genomischen Kontext überprüft. Hierzu erfolgte eine Transfektion von kaninen, GLB1-defizienten-Fibroblasten sowie von Wildtyp-Fibroblasten mit verschiedenen Vektoren, die die Zinkfingernukleasen separat bzw. als Doppelkonstrukt in Form eines polyzystronischen Expressionsvektors enkodieren. Allerdings konnte weder in Wildtyp- noch in GLB1- defizienten-Fibroblasten ein DSB am Targetlokus mittels eines T7-Endonuklease Assays nachgewiesen werden. Anschließend wurde, mit dem Ziel eine durch Homologe Rekombination (HR) vermittelte Genreparatur in GLB1mut/GLB1mut-Fibroblasten zu erzielen, eine Kotransfektion der Zinkfingernukleasevektoren und eines repair template-Konstruktes vorgenommen. Die Reparatursequenz enthielt 3’ Anteile des Intron 14, das vollständige Wildtyp-Exon 15 sowie das 5´ Segment des Intron 15. Parallel wurde versucht, die Mutation im GLB1 Exon 15 kaniner Wildtyp-Fibroblasten durch die Kotransfektion eines repair templates zu induzieren, welches neben den für die HR notwendigen Intronsequenzen eine mutierte, die 19 bp Duplikation enthaltende Exon 15 Sequenz beinhaltete. Das jeweilige repair template, wurde als separates Konstrukt sowohl in linearisierter, als auch in zirkulärer Form transfiziert. Allerdings konnte über eine Polymerasekettenreaktion (PCR) und anschließender nested PCR im Genom der transfizierten Zellen keine Geneditierung festgestellt werden. Dementsprechend ist davon auszugehen, dass die Funktionalität der hergestellten Zinkfingernuklease-Konstrukte im genomischen Kontext nicht gegeben ist. In der Zwischenzeit haben verschiedene Publikationen die Verwendung von transcription activator-like effector nucleases (TALENs) beschrieben, welche mit hoher Frequenz gezielte Veränderungen mittels homologer Rekombination im Genom erlaubten. Daher wurde die im Antrag beschriebene Strategie entsprechend angepasst, und als Alternative zu der vorgesehenen Verwendung von Zinkfingern TALENs hergestellt, die im Bereich der ZFN-Targetsequenz binden. Nach Transfektion der TALEN-enkodierenden Plasmide wurde die TALEN-Expression mittels Immunfluoreszenez in ca. 30 % der kaninen Wildtyp- sowie GLB1-defizienten Fibroblasten nachgewiesen. Weitere in vitro-Experimente für die Validierung der TALEN- vermittelten Modifikation des GLB1-Lokus werden derzeit durchgeführt (Stand Oktober 2013). Im Rahmen dieses Projektes wurden verschieden Vektoren für den Transport der ZFN und der repair template-Sequenz in den Kern der Zielzellen entwickelt. Sie basieren auf Tollwut Virus-Glykoprotein (Rab-G) sowie Vesikular Stomatitis Virus-Glykoprotein (VSV-G) pseudotypisierten, integrierenden und Integrase-defizienten Lentiviren. Aufgrund der nicht vorhandenen Funktionsfähigkeit der ZFN wurde jedoch von einer Klonierung in das lentivirale backbone preGFPsin abgesehen. Für die Herstellung von transgenen Mäusen sollte das interne Glb1 Exon 15 durch den kaninen Genomabschnitt (GLB1 Intron 14 - Exon 15 mut - Intron 15) ersetzt werden. Es wurde eine, alternative, vielversprechendere Strategie gewählt, da es nach vielen verschiedenen technischen Ansätzen nicht möglich war, ein geeignetes Targetingkonstrukt herzustellen. Es wurde ebenfalls eine Methodik gewählt und verfolgt, der auf spezifischen TALENs basiert, die sowohl zur Transfektion von ES-Zellen als auch zur Einführung in befruchtete Oozyten verwendet werden können. Zur Überprüfung der Funktionsfähigkeit wurden diese TALENs in der Zwischenzeit in Maus-Blastozysten getestet. In einer von 14 injizierten Blastozysten wurde die integrierte kanine Sequenz mittels PCR nachgewiesen. Die Mikroinjektionen in befruchtete Oozyten sowie der Embryotransfer erfolgen zur Zeit (Stand Oktober 2013). Zusammenfassend lässt sich aufgrund der von uns vorgenommen Studien sagen, dass der Ansatz mit Zinkfingernukleasen vielversprechend war und dem damaligen Stand der Technik entsprach. Allerdings zeigte sich im Verlauf unserer Untersuchungen, dass diese Technologie aufgrund ihrer technischen Limitationen nicht für den vorgesehenen Ansatz geeignet ist. Es wurde daher ein alternativer Ansatz gewählt, der auf einer Editierung des kaninen GLB1 Lokus mittels TALENs basiert. Dieselbe Methodik wurde für die Herstellung der transgenen Mauslinie gewählt. Die ersten positiven Ergebnisse für die alternativen Ansätze bestätigen diese Strategie.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Culturing adult canine sensory neurons to optimise neural repair. Veterinary Record 2012;170:102
Gerhauser I., Hahn K., Baumgärtner W., Wewetzer K.
