Analysis of the mechanisms by which chloroplast HSP70 chaperone activity is regulated
Final Report Abstract
Das Ziel dieses Projektes war ein besseres Verständnis der Regulation der ATPase- und Faltungsaktivität des plastidären Hsp70-Systems zu erhalten. Hierfür wurden zunächst die Komponenten des bakteriellen Hsp70-Systems aus E. coli (DnaK, DnaJ, GrpE) und die des plastidären Hsp70-Systems aus dem Chloroplasten von Chlamydomonas reinhardtii (HSP70B, CDJ1, CDJ3, CDJ4, CGE1a, CGE1b, sowie N-terminale Deletionen von CGE1) rekombinant hergestellt. Anschließend wurden ATPase-, Luciferase-Faltungs- und Malat-Dehydrogenase-Aggregationsassays etabliert und die Aktivitäten beider Hsp70-Systeme einzeln und in Kombination gemessen. Beide Systeme zeigten ATPase-Aktivität und unterstützten die Faltung von Luciferase in den nativen Zustand. DnaK als auch HSP70B konnten die ATP-abhängige Faltung von Luciferase in den nativen Zustand nur dann effizient katalysieren, wenn ihre Kochaperone DnaJ/GrpE bzw. CDJ1/CGE1 zugegen waren. Das Verhältnis von HSP70B zu jedem Kochaperon musste ausgewogen sein, der Überschuss eines der Kochaperone war kontraproduktiv. Obwohl DnaK mit den plastidären Kochaperonen und HSP70B mit den bakteriellen Kochaperonen Luciferase falten konnte, war die Faltungseffizient deutlich geringer als im homologen System, was auf eine Koevolution der Kochaperone mit ihren Hsp70-Partnern hindeutet. Die ATPase von HSP70B wies ca. 20-fach höhere Werte für Vmax und Km auf als die ATPase von DnaK und das HSP70B-System hatte eine ca. 6-fach höhere Faltungseffizienz für denaturierte Luciferase als das DnaK-System. Die Deletion von bis zu 16 N-terminalen Aminosäuren im reifen CGE1-Protein hatte im physiologischen Temperaturbereich keinen Einfluss auf die ATPase- oder Faltungsaktivität von HSP70B, weitere Deletionen im N-Terminus von CGE1 hingegen schon. Die Inkubation von HSP70B mit oxidiertem Glutathion (GSSG) führte zu einer Hemmung seiner ATPase- Aktivität und konvertierte das faltungsaktive Chaperon in eines, das effizient die Aggregation eines denaturierten Substratproteins verhindert. Dieser Effekt war durch DTT revidierbar, ein Effekt der spezifisch durch Thioredoxin y und Glutaredoxin 1 verstärkt wurde. Der hemmende Effekt von GSSG wirkte auf die ATPase-Domäne von HSP70B und verblieb, auch wenn alle drei Cysteine in dieser Domäne mutiert worden waren. Dieser überraschende Befund deutet auf eine allosterische Regulation von HSP70B durch GSSG hin. HSP70B benötigt das plastidäre Eskort-Protein HEP2 um in den nativen Zustand zu falten. Wir konnten zeigen, dass das mitochondriale Eskort-Protein HEP1 plastidäres HSP70B mit gleicher Effizienz wie HEP2 falten kann. Das Chloroplasten-Transitpeptid von HSP70B verhindert die Faltung von HSP70B in den nativen Zustand nicht. Tatsächlich kann denaturiertes HSP70B nach Verdünnung in einen nativen Puffer von HEP2 in Gegenwart von ATP in den nativen Zustand gefaltet werden. HEP2 interagiert offenbar auch mit faltungsaktivem HSP70B. Es konnte ein HEP2-HSP70B Komplex modelliert werden. Die ermittelte Bindestelle von HEP2 auf HSP70B ist im Einklang mit allen experimentellen Daten und allein die Ladungsverteilung an dieser Stelle erklärt, warum HEP2 mit HSP70B, aber nicht mit DnaK interagieren kann. Das plastidäre Enzym, das Chloroplast-Transitpeptide spaltet (CPE1), konnte funktional rekombinant hergestellt werden. Es war in der Lage Transitpeptide von HSP70B und HSP22E/F korrekt zu prozessieren und erlaubt, Transitpeptid-Spaltstellen zukünftig experimentell in vitro zu bestimmen.
Publications
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