Strukturbestimmung von Proteorhodopsin mittels NMR Spektroskopie
Final Report Abstract
Strukturbestimmung von Membranproteinen stellt noch immer eine große Herausforderung dar. Wir haben in den letzten Jahren ein zellfreies Expressionssystem etabliert, das auf die Expression größerer Mengen von Membranproteinen für strukturelle Untersuchungen optimiert ist. Da in zellfreien Synthese der zelluläre Metabolismus weitestgehend unterdrückt ist, ist diese Methode bestens geeignet, um seletiv markierte Proteine herzustellen, in denen nur bestimmte Aminosäuren oder sogar nur bestimmte chemische Gruppen in diesen Aminosäuren markiert sind. Wir wollten die Struktur des Membranproteins Proteorhodopsin mittels NMR Spektroskopie ermitteln und dabei den Einsatz von speziell markierten Aminosäuren (SAIL amino acids) testen, die nur an bestimmten Stellen 13C und 1H und sonst nur 12C und 2H markiert sind. Proteorhodopsin ist ein eubakterielles Retial-Bindungsprotein und stellt funktional eine Lichtgetriebene Protonenpumpe dar. Es besteht aus 7 Transmembran Helices mit insgesamt 249 Aminosäuren. Wir haben die Expression des Proteins in unserem zellfreien Expressionssystem optimiert und mittels NMR Spektroskopie seine Struktur gelöst. Strukturelle Parameter haben wir dabei sowohl in Form von NOEs gemessen, die durch den Einsatz der speziell markierten Aminosäuren gemessen werden konnten als auch in Form der sogenannten PREs, bei denen man eine paramagnetische Spinsonde an verschiedenen Stellen im Protein anbringt und die Distanz-abhängige Linienverbreiterung der Amidprotonen misst. Die von uns gelöste Struktur zeigte, dass Proteorhodopsin – im Gegensatz zu allen anderen Retinal-Bindungsproteinen – zwischen den Helices B und C kein β-Faltblatt besitzt, dass aber der als ungefaltet angenommene Loop zwischen den Helices E und F α-helical ist. Zusätzlich zu dieser Strukturbestimmung haben wir die Dynamik untersucht. Dabei stellte es sich heraus, dass besonders Aminosäuren, die die Bindungstasche des Retial Cofaktors bilden, eine starke Linienverbreitung aufwesien, was auf einen Austausch zwischen verschiedenen Konformationen zurückzuführen ist. Diese Dynamik wird im Augenblick weiter untersucht. Ferner haben wir untersucht, wie genau Strukturen sein können, die nur mittels PREs berechnet werden. Hierzu haben wir 3 verschiedene Membranproteine mit bekannter Struktur genommen und aufgrund dieser Strukturen Distanzeinschränkungen durch verschieden angebrachte Spinsonden simuliert. Dabei stellte sich heraus, dass es ausreichend ist, wenn eine Spinsonde pro Helix verwendet wird, solange diese Spinsonden alternierend an den beiden Membranseiten des Proteins angebracht werden. Zudem können bei den Rechnungen große Fehler bei der Messung der PREs angenommen werden. Solange genügend PREs gemessen werden, leidet die Genauigkeit der Strukturbestimmung kaum. Im letzten Teilprojekt haben wir ein neues Markierungsschema mit markierten Aminosäuren entwickelt, mit dessen Hilfe die Zuordnung der Rückgratsignale von Membranproteinen schneller und effizienter erfolgen kann.
Publications
- Solution NMR structure of proteorhodopsin. Angewandte Chemie, 2011. 50(50): p. 11942-6
Reckel, S., D. Gottstein, J. Stehle, F. Lohr, M.K. Verhoefen, M. Takeda, R. Silvers, M. Kainosho, C. Glaubitz, J. Wachtveitl, F. Bernhard, H. Schwalbe, P. Güntert, and V. Dötsch
- Characterization of the ground state dynamics of proteorhodopsin by NMR and optical spectroscopies. Journal of biomolecular NMR, 2012. 54(4): p. 401-13
Stehle, J., F. Scholz, F. Löhr, S. Reckel, C. Roos, M. Blum, M. Braun, C. Glaubitz, V. Dötsch, J. Wachtveitl, and H. Schwalbe
(See online at https://doi.org/10.1007/s10858-012-9684-8) - Combinatorial triple-selective labeling as a tool to assist membrane protein backbone resonance assignment. Journal of biomolecular NMR, 2012. 52(3): p. 197-210
Löhr, F., S. Reckel, M. Karbyshev, P.J. Connolly, N. Abdul-Manan, F. Bernhard, J.M. Moore, and V. Dötsch
(See online at https://doi.org/10.1007/s10858-012-9601-1) - Requirements on paramagnetic relaxation enhancement data for membrane protein structure determination by NMR. Structure, 2012. 20(6): p. 1019-27
Gottstein, D., S. Reckel, V. Dötsch, and P. Güntert
(See online at https://doi.org/10.1016/j.str.2012.03.010)
