Universelles Mess-System für Einzelmolekülfluoreszenz

• Subject Area: Basic Research in Biology and Medicine
• Term: Funded in 2010
• Project identifier: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Project number 179783927

• Final Report Year: 2014

Final Report Abstract

Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere mit Einzelmolekülempfindlichkeit, wird in der Gruppe Nienhaus in diversen Projekten zur Untersuchung der biomolekularen Strukturdynamik eingesetzt. 1. Untersuchung der Protein-Nanopartikel- und Nanopartikel-Zell-Wechselwirkungen (im Rahmen des SPP1313): Nanopartikel werden einerseits als wichtige Werkzeuge in der medizinischen Diagnostik und Therapie betrachtet, andererseits gibt es Bedenken, dass sie gesundheitlich problematisch sein können bei nicht beabsichtigter Exposition und Inkorporation, die bei der industriellen Verwendung unvermeidbar ist. In biologischen Fluiden (z. B. Blut, Lymphe, Lungenflüssigkeit) werden Nanopartikel sofort von einer Proteinadsorptionsschicht (Proteinkorona) eingehüllt, die die eigentlichen physikochemischen Eigenschaften der Partikel maskiert und stattdessen die Interaktion der Nanopartikel mit Biomaterialen wie z. B. Zellen bestimmt. Wir verwenden die Zwei-Fokus-Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (2fFCS), um die Adsorption von Proteinen auf fluoreszenten Nanopartikeln quantitativ zu untersuchen. Insbesondere werden die Dicke der Proteinkorona, Bindungsaffinitäten, Reversibilität der Adsorption, oder auch kinetische Ratenkoeffizienten bestimmt. FCS basiert auf der Detektion der Emission einzelner Fluorophore, wenn diese durch das konfokale Volumen des Mikroskops diffundieren. Die Teilchenmobilität ändert sich mit der Größe der diffundierenden Teilchen, und Radiusänderungen von etwa 0.1 nm können quantitativ bestimmt werden. Fluoreszente Nanopartikel (z.B. Quantenpunkte, Gold/Silbernanocluster) werden in der Arbeitsgruppe synthetisiert. Die Charakterisierung eines jeden neuen Labels umfasst stets die Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer. So zeigen Goldnanocluster eine stark temperaturabhängige Fluoreszenzlebensdauer und -intensität im physiologischen Temperaturbereich (15 – 45 °C). Mithilfe der auf zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung (time-correlated single photon counting, TCSPC) basierenden Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM) konnten wir die Anwendung von Goldnanoclustern für die lokale Temperaturmessung in lebenden Zellen aufzeigen. 2. Stabilität und Funktion von Proteinen in nanostrukturierten Umgebungen: Proteine sind dynamische Makromoleküle, die ständig zwischen verschiedenen Konformationen fluktuieren. Durch systematische Beobachtungen von Strukturfluktuationen einer Anzahl wohlselektierter Modellproteine durch zeitlich aufgelöste Messungen des FRET Signals werden Details der Faltungsdynamik analysiert, zum Beispiel die Existenz von Faltungsintermediaten. Neben Faltungsübergängen werden Strukturfluktuationen im gefalteten Zustand untersucht. Bei diesen Arbeiten wurde die Multiparameter-Detektion verwendet: Die simultane Erfassung der Intensität, der Polarisation sowie der Fluoreszenzlebensdauer in zwei Farbkanälen ermöglicht eine optimale Charakterisierung von Konformationsfluktuationen. 3. Konformationsfluktuationen und Strukturänderungen kleiner Nukleinsäuremoleküle: Mithilfe von Einzelmolekül-FRET-Messungen haben wir die molekulare Dynamik der Konformations­umwandlungen kleiner Nukleinsäuremoleküle in Echtzeit beobachtet. Neben enzymatisch aktiven RNAs (Ribozyme) haben wir insbesondere Riboswitches untersucht. Bei ihnen bewirkt das Anbinden eines Metaboliten an die Sensordomäne eine strukturelle Reorganisation der RNA, wodurch die Proteinproduktion beeinflusst wird. 4. Entwicklung von Methoden zur Analyse von Multidomänenproteinen und deren Anwendung auf die Untersuchung von Zellpolaritätsproteinen in vitro und in vivo: Im Rahmen dieses Projektes wurden die Eigenschaften von SNAPtag und CLIPtag Domänen als FRET-Paar charakterisiert. Diese Proteine können orthogonal mit spezifischen synthetischen Farbstoffen markiert werden und werden deshalb in zellulären Anwendungen als Fusionspartner eingesetzt. Wir haben hier zunächst insbesondere SNAPtag-CLIPtag Fusionsproteine mit variierenden Linkerpeptiden im Detail untersucht.

Publications

• Characterization of Protein Adsorption onto FePt Nanoparticles using Dual-focus Fluorescence Correlation Spectroscopy. Beilstein J. Nanotechnol. 2 (2011) 374-383
  Maffre, P., Amin, F., Parak, W. J., Nienhaus, K., & Nienhaus, G. U.
  
• One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small 7 (2011) 2614-2620
  Shang, L., Azadfar, N., Stockmar, F., Send, W., Trouillet, V., Bruns, M., Gerthsen, D., Nienhaus, G. U.
  
• A Combined Single-molecule FRET and Tryptophan Fluorescence Study of RNase H Folding under Acidic Conditions. Chem. Phys. 396 (2012) 3-9
  Rieger, R., & Nienhaus, G. U.
  
• Effect of Protein Adsorption on the Fluorescence of Ultrasmall Gold Nanoparticles. Small 8 (2012) 661-665
  Shang, L., Brandholt, S., Stockmar, F., Trouillet, V., Bruns, M., & Nienhaus, G. U.
  
• Microwave-assisted Rapid Synthesis of Luminescent Gold Nanoclusters for Sensing Hg2+ in Living Cells Using Fluorescence Imaging. Nanoscale 4 (2012) 4155-4160
  Shang, L., Yang, L., Stockmar, F., Popescu, R., Trouillet, V., Bruns, M., Gerthsen, D., & Nienhaus, G. U.
  
• Intracellular Thermometry by Using Fluorescent Gold Nanoclusters. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (2013) 11154-11157
  Shang, L., Stockmar, F., Azadfar, N., & Nienhaus, G. U.
  
• Polymer-coated Nanoparticles Interacting with Proteins and Cells: Focusing on the Sign of the Net Charge. ACS Nano 7 (2013) 3253-3263
  Hühn, D., Kantner, K., Geidel, C., Brandholt, S., De Cock, I., Soenen, S. J., Rivera Gil, P., Montenegro Martos, J. M., Braeckmans, K., Müllen, K., Nienhaus, G. U., Klapper, M., & Parak, W. J.
  
• Studying the Protein Corona on Nanoparticles by FCS. Methods Enzymol. 519 (2013) 115-137
  Nienhaus, G. U., Maffre, P., & Nienhaus, K.
  
• Temperature - The “Ignored” Factor at the NanoBio Interface. ACS Nano 7 (2013) 6555-6562
  Mahmoudi, M., Abdelmonem, A. M., Behzadi, S., Clement, J. H., Dutz, S., Ejtehadi, M. R., Hartmann, R., Kantner, K., Linne, U., Maffre, P., Metzler, S., Moghadam, M. K., Pfeiffer, C., Rezaie, M., Ruiz-Lozano, P., Serpooshan, V., Shokrgozar, M. A., Nienhaus, G. U., & Parak, W. J.
  
• Carbohydrate-Lectin Recognition of Sequence-defined Heteromultivalent Glycooligomers. J. Am. Chem. Soc. 136 (2014) 2008-2016
  Ponader, D., Maffre, P., Aretz, J., Pussak, D., Ninnemann, N. M., Schmidt, S., Seeberger, P. H., Rademacher, C., Nienhaus, G. U., Hartmann, L.
  
• Complex RNA Folding Kinetics Revealed by Single Molecule FRET and Hidden Markov Models. J. Am. Chem. Soc. 136 (2014) 4534-4543
  Keller, B. G., Kobitski, A. Y., Jäschke, A., Nienhaus, G. U., & Noe, F.
  
• Impact of Protein Modification on the Protein Corona on Nanoparticles and Nanoparticle-Cell Interactions. ACS Nano 8 (2014) 503-513
  Treuel, L., Brandholt, S., Maffre, P., Wiegele, S., Shang, L., & Nienhaus, G. U.
  
• Nanoparticles Interacting with Proteins and Cells: A Systematic Study of Protein Surface Charge Effects. Adv. Mater. Interfaces 2014, 1, 1300079
  Shang, L., Yang, L., Seiter, J., Heinle, M., Brenner-Weiss, G., Gerthsen, D., & Nienhaus, G. U.