Charakterisierung der Tumorsuppressorfunktion von APC/C Cdh1 durch Live-Cell-Imaging
Final Report Abstract
Um Transformation und malignes Wachstum zu verhindern, muss jede Zelle ihre genetische Stabilität erhalten. Dazu ist die Sicherstellung der korrekten DNA-Replikation und Chromosomentrennung während jeder Zellteilung zwingend erforderlich. Der proteolytische Abbau von Zellzyklusregulatoren durch die Ubiquitin-Ligase Anaphase-Promoting Komplex (APC/C) ist ein zentraler Mechanismus der Zellzyklusregulation. In einer früheren Arbeit haben wir ein Modell postuliert, wie die aktivierende Untereinheit Cdh1 des APC/C als Tumorsuppressor fungiert, indem sie für den Erhalt der genetischen Stabilität sorgt. Wir haben auch herausgefunden, dass Cdh1 in zahlreichen Zelllinien von soliden Tumoren oder hämatologischen Neoplasien herunterreguliert ist. Darüberhinaus konnte von anderen gezeigt werden, dass heterozygote Cdh1-Knockoutmäuse epitheliale Tumoren, Myelodysplasien oder Plasmazelldyskrasien entwickeln können. Es ist aber bislang unklar, auf welche Weise genetische Instabilität durch die verminderte Cdh1-Aktivität entsteht. Die Analyse von Cdh1-Knockdown (kd)-Zellen ergab eine starke nukleäre Stabilisierung der Substrate Cyclin A und B, welches zu einer verminderten Beladung der Replikationsursprünge mit MCM Proteinen in der G1-Phase führt. Die Behandlung mit dem Cdk1-Inhibitor RO-3306 konnte diese reduzierte Beladung umkehren. Während die Stabilisierung von Cyclin A und B und die damit verbundene unzeitgemäße Zellzyklusaktivität von Cdk1 und Cdk2 den verfrühten S-Phase-Eintritt mitverursachen kann, kann die verminderte Beladung mit MCM-Proteinen zu einer verlängerten DNA-Replikation in Cdh1-kd-Zellen führen. Die Wiederherstellung der Cdh1- abhängigen G2-Schadenantwort durch Plk1-Inhibition führt nicht zu einem G2-Arrest, sondern zu einem Block in Prometaphase. Dies erlaubt die Schlussfolgerung, dass Cdh1-kd-Zellen trotz unvollständiger DNA-Replikation in Mitose eintreten. Das Chemotherapeutikum Doxorubicin, welches DNA-Schaden induziert, blockiert Cdh1-kd-Zellen bei niedrigeren Konzentrationen als Kontrollzellen, d.h. Cdh1-kd-Zellen zeigen eine höhere Anfälligkeit gegenüber zusätzlichem Replikationsstress. Unterreplizierte DNA und Replikationsgabeln in Mitose können für die genetische Instabilität und die komplexen Mitoseaberrationen von Cdh1-kd-Zellen verantwortlich sein. Vermehrte γH2AX und 53BP1 Foci deuten auf Doppelstrangbrüche (DSB) von Replikationsgabeln während der Chromosomenkondensation und –trennung hin. Die Reparatur von solchen DSB durch Nicht-homologe-End-zu-End-Verbindung (Non-homologousend-joining, NHEJ) in G1 kann zu Anaphasebrücken in der folgenden Mitose führen. Anaphasebrücken und Fehler bei der Chromosomentrennung kann zu Zytokinesedefekten und Tetraploidie führen. Tetraploidie verursacht überzählige Zentrosomen und multipolare Mitosen oder Zentrosomclustering mit merotelischen Chromosomenverbindungen und sog. „lagging Chromosomes“. Während viele dieser Ereignisse zur mitotischen Katastrophe und Apoptose führen, können sich in überlebenden Zellen numerische und strukturelle Chromsomenaberrationen anhäufen, wie sie im Knockout-Mausmodell beschrieben sind. Zusammenfassend führt die Herunterregulierung des Tumorsuppressors Cdh1 zu einer Fehlregulation der DNA-Replikation durch die Stabilisierung von Cyclin A und B in G1 und die verminderte Beladung von Replikationsursprüngen mit MCM-Proteinen. Dies wiederum hat eine zunehmende genomische Instabilität und DNA-Schaden zur Folge. Medikamente die DNA-Schaden induzieren sind möglicherweise besonders wirksam in Tumorzellen mit einer verminderten Cdh1-Expression.
Publications
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