Konfokales Laserscanning-Mikroskop
Final Report Abstract
Zu den wesentlichen Forschungszielen die mit der Nutzung des Laserscanning-Mikroskops Leica SP5II verfolgt werden zählen zum einen die Aufklärung der subzellulären Lokalisierung löslicher und membrangebundener Proteine, zum anderen die Ermittlung von Protein-Protein Wechselwirkungen mit Hilfe Bimolekularer Fluoreszenzkomplementation (BIFC). Im Folgenden sind Beispiele für Forschungsprojekte aufgelistet die mit Hilfe des Gerätes erfolgreich bearbeitet wurden und bereits publiziert sind. 1. Kupfer ist ein wichtiger Kofaktor für Proteinvermittelte Elektronen-Transferprozesse. Einer der Kupfertransporter aus Arabidopsis, COPT5, konnte als GFP-Fusionsprotein in Protoplasten transient synthetisiert und als an der Vakuolenmembran lokalisiert identifiziert werden. Er fungiert als Exporter für Kupfer welches in diesem Kompartiment gespeichert wird. Damit ist er an der Umverteilung von Kupfer aus der Wurzel in die Blütenorgane beteiligt, was sich in veränderten Kupfergehalten in entsprechenden Mutanten äußerte. 2. Mit PmANT1 konnte ein ATP Exporter an der Plasmamembran von Arabidopsis-Zellen identifiziert werden. Er steht damit in physiologischem Zusammenhang mit der Signalfunktion von extrazellulärem ATP, der entsprechende Rezeptor (DOes not Respond to Nucleotides, DORN1) wurde dieses Jahr identifiziert. PmANT1 Mutanten zeigten vor allem eine eingeschränkte Fähigkeit zur Öffnung der Antheren und damit verminderte Fertilität. 3. Die Fähigkeit zur Speicherung von Zuckern in der Vakuole ist sehr bedeutsam während der Pflanzenentwicklung. Entsprechende Zuckertransporter konnten von uns in der Vergangenheit identifiziert werden. Kürzlich konnte auch eine Kinase (VIK) identifiziert werden die für die Aktivitätsregulation der Transporter verantwortlich ist. BIFC Analysen zeigten die direkte Interaktion zwischen dem Transporter und VIK. 4. Die Neusynthese von Nukleotiden ist ein essentieller Prozess in allen Organismen. In Pflanzen wird die Synthese von Pyrimidinen in den Plastiden initiiert. Mithilfe von Protein-GFP Fusionskonstrukten die transient in Protoplasten synthetisiert wurden konnte die subzelluläre Lokalisierung der weiteren enzymatischen Reaktionen aufgeklärt werden. 5. Während Zuckerimporter bereits seit längerem bekannt waren wurde erst kürzlich eine Proteinfamilie identifiziert deren Mitglieder für den Export von Zuckern verantwortlich sind. Innerhalb dieser als SWEETs benannten Proteinfamilie konnte SWEET16 als vakuolärer Exporter für Glukose, Fruktose und Saccharose beschrieben werden. Neben anderen Beobachtungen zeigten SWEET16 Überexpressionslinien eine erhöhte Frosttoleranz. Dies ist ein deutlicher Hinweis auf die Wichtigkeit der subzellulären Verteilung von Glukose und Fruktose unter Kälteeinwirkung. Ein weiterer, Glukose spezifischer Exporter konnte mit AtERDL6 identifiziert werden. Dieses Protein lokalisiert ebenfalls in der Tonoplastenmembran. 6. Die erstmalige biochemische Charakterisierung von zwei Transportproteinen der Nukleobasen-Ascorbat Transporter (NAT) aus Arabidopsis vervollständigt unser Bild über entsprechende Transportvorgänge. Substrat von NAT3 und NAT12 sind Uracil, Guanin und Adenin, nicht jedoch Ascorbat. Beide Proteine sind Plasmamembran-ständig.
Publications
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A member of the mitogen-activated protein 3-kinase family is involved in the regulation of plant vacuolar glucose uptake. Plant J. (2011) 68, 890-900
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Identification of an Arabidopsis plasma membrane located ATP transporter important for anther development. Plant Cell (2011) 23, 1932-1944
Rieder B, Neuhaus HE
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The tonoplast copper transporter COPt5 acts as an exporter and is required for inter-organ allocation of copper in Arabidopsis thaliana. New Phytologist (2011) 192, 393-404
Klaumann S, Nickolaus SD, Fürst SH, Starck S, Schneider S, Neuhaus HE, Trentmann O
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De novo pyrimidine nucleotide synthesis mainly locates outside of plastids, but a novel nucleobase importer provides substrates for the essential salvage pathway. Plant Cell (2012) 24, 1549-1559
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Overexpression of the vacuolar sugar carrier AtSWEET16 modifies germination, growth and stress tolerance in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. (2013) 163, 1338-1352
Klemens PAW, Patzke K, Deitmer D, Spinner L, Le Hir R, Bellini C, Bedu M, Chardon F, Krapp A, Neuhaus HE
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Biochemical characterization and structure-function relationship of two plant NCS2 proteins, the nucleobase transporters NAT3 and NAT12 from Arabidopsis thaliana. Biochimica et Biophysica Acta BBA - Biomembranes, Volume 1838, Issue 12, December 2014, Pages 3025-3035
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Overexpression of a proton-coupled vacuolar glucose exporter impairs freezing tolerance and seed germination. New Phytol. (2014) 202, 188-197
Klemens PAW, Patzke K, Trentmann O, Poschet G, Büttner M, Schulz A, Marten I, Hedrich R, Neuhaus HE
