Spinning Disk Konfokalmikroskop
Final Report Abstract
Das Spinning Disk Laser-Konfokalmikroskop hat uns Möglichkeiten eröffnet, Konfokalmikroskopie-Experimente an lebenden Zellkulturen und Geweben durchführen zu können. Mit diesem Instrument können 2D und 3D Bildsequenzen in schneller Folge (30 – 100 ms für Einzelbilder) mit sehr hoher Detektionseffizienz aufgenommen werden, so dass die Belastung der Zellen durch die Lichteinstrahlung gering ist. Eine FRAPPA-Einheit ermöglicht es, Dynamik über die Erholung der Fluoreszenz einer gezielt ausgebleichten Region bzw. über die Photoaktivierung von geeigneten Fluorophoren zu untersuchen. Das Mikroskop wird in mehreren Projekten eingesetzt, wobei in den letzten Jahren die Quantifizierung der Endozytose von Nanopartikeln im Vordergrund stand. Nanopartikel werden einerseits als wichtige Werkzeuge in der medizinischen Diagnostik und Therapie betrachtet, andererseits gibt es Bedenken, dass sie gesundheitlich problematisch sein können bei nicht beabsichtigter Exposition und Inkorporation, die bei der industriellen Verwendung unvermeidbar ist. In biologischen Fluiden (z. B. Blut, Lymphe, Lungenflüssigkeit) werden Nanopartikel sofort von einer Proteinadsorptionsschicht (Proteinkorona) eingehüllt, die die eigentlichen physikochemischen Eigenschaften der Partikel maskiert und die Interaktion der Nanopartikel mit Biomaterialen wie z. B. Zellen bestimmt. Wir haben die Spinning Disk Mikroskopie intensiv genutzt, um die Endozytose von fluoreszenten Nanopartikeln quantitativ zu untersuchen. Insbesondere werden die Kinetik der Aufnahme in verschiedene Zelltypen, die aufgenommenen Menge sowie die anschließende Exozytose analysiert. Die fluoreszenten Nanopartikel (z.B. Halbleiter-Quantenpunkte, Gold/Silbernanocluster) wurden zum Teil in der Arbeitsgruppe synthetisiert, zum Teil von Kooperationspartnern bereitgestellt. Im Rahmen des von der Landesstiftung BW finanzierten Projektes „Entwicklung von Methoden zur Analyse von Multidomänenproteinen und deren Anwendung auf die Untersuchung von Zellpolaritätsproteinen in vitro und in vivo“ wurden die SNAP-tag und CLIP-tag Domänen in ihrer Funktion als FRET-Paar charakterisiert. Diese Proteine werden orthogonal mit spezifischen synthetischen Farbstoffen markiert und dann in zellulären Anwendungen als Fusionspartner eingesetzt. Wir haben insbesondere SNAP-tag ‒ CLIP-tag Fusionsproteine mit variierenden Linkerpeptiden im Detail untersucht. Ein weiteres Projekt an befasst sich mit den molekularen Mechanismen, die der Reparatur der Plasmamembran nach einer Schädigung zugrunde liegen. Erste Untersuchungen an Zebrafischembryonen unter Verwendung der Spinning Disk Mikroskopie haben erste interessante Einblicke in diesen sehr komplizierten Prozess gegeben.
Publications
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Gold Nanoclusters as Novel Optical Probes for in Vitro and in Vivo Fluorescent Imaging. Biophys. Rev. 4 (2012) 313-322
Shang, L., & Nienhaus, G. U.
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Microwave-assisted Rapid Synthesis of Luminescent Gold Nanoclusters for Sensing Hg2+ in Living Cells Using Fluorescence Imaging. Nanoscale 4 (2012) 4155-4160
Shang, L., Yang, L., Stockmar, F., Popescu, R., Trouillet, V., Bruns, M., Gerthsen, D., & Nienhaus, G. U.
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Toward a Molecular Understanding of Nanoparticle-Protein Interactions. Biophys. Rev. 4 (2012) 137-147
Treuel, L., & Nienhaus, G. U.
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Ultrasmall Fluorescent Silver Nanoclusters: Protein Adsorption and its Effects on Cellular Responses. Nano Research 5 (2012) 531-542
Shang, L., Dörlich, R. M., Trouillet, V., Bruns, M., & Nienhaus, G. U.
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Mechanistic Aspects of Fluorescent Gold Nanocluster Internalization by Live HeLa Cells. Nanoscale 5 (2013) 1537-1543
Yang, L., Shang, L., & Nienhaus, G. U.
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New Views on Cellular Uptake and Trafficking of Manufactured Nanoparticles. J. R. Soc. Interface 10 (2013) 20120939
Treuel, L., Jiang, X., & Nienhaus, G. U.
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Small Fluorescent Nanoparticles at the Nano-Bio Interface. Materials Today 16 (2013) 5866
Shang, L., & Nienhaus, G. U.
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Impact of Protein Modification on the Protein Corona on Nanoparticles and Nanoparticle-Cell Interactions. ACS Nano 8 (2014) 503-513
Treuel, L., Brandholt, S., Maffre, P., Wiegele, S., Shang, L., & Nienhaus, G. U.
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Nanoparticles Interacting with Proteins and Cells: A Systematic Study of Protein Surface Charge Effects. Adv. Mater. Interf. 1 (2014) 201300079
Shang, L., Yang, L., Seiter, J., Heinle, M., Brenner-Weiss, G., Gerthsen, D., & Nienhaus, G. U.
