Generierung einer NADP+-abhängligen Glykolat-Dehydrogenase mit Hilfe von "directed evolution" und in vivo Analyse ihrer Einsetzbarkeit zur Reduzierung der pflanzlichen Photorespiration

• Antragsteller: Professor Dr. Martin Engqvist
• Fachliche Zuordnung: Biochemie und Biophysik der Pflanzen
• Förderung: Förderung von 2010 bis 2014
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 191228634

Die pflanzliche Photorespiration ist ein äußerst energieaufwendiger und unerwünschter Nebeneffekt der Photosynthese und führt zu Ernteeinbußen essentieller Pflanzen wie bspw. Kartoffel, Weizen oder Reis. Kürzlich zeigten biotechnologische Ansätze durch zusätzliche Stoffwechselwege in den Chloroplasten sowohl eine Reduktion der Photorespiration als auch eine Erhöhung der Biomasse. Für diese Stoffwechselwege fehlt jedoch bis dato eine Glycolat-Dehydrogenase (GDH), die optimal geeignet ist und keine negativen Nebeneffekte aufzeigt. Im vorgestellten Projekt soll daher eine äußerst effiziente NADP+ abhängige GDH durch directed evolution generiert werden, welche dann in vivo in Pflanzen genutzt werden könnte. Hierzu werden folgende vier Ziele definiert.Im ersten Schritt werden verschiedene Dehydrogenasen aus Pflanzen, Pilzen oder Bakterien in Escherichia coli kloniert und ihre NADP+ abhängige Dehydrogenaseaktivtät für Glykolat gemessen. Im zweiten Schritt wird eine Auswahl dieser Gene zusammen mit einer Arabidopsis thaliana Glyoxylat Reduktase, die bekannterweise Glykolat mit NADP+ als Cofaktor oxidiert, für directed evolution genutzt. Ziel hierbei ist es, duch Mutangenese und gezielte Selektion, die spezifische GDH Aktivität der Enzyme signifikant zu steigern. Abschließend wird mithilfe von Zufalls-PCR jede erdenkliche Kombination von Mutationen, die positive Auswirkungen zeigen, generiert und auf gesteigerte Enzymaktivität getestet. Die dritte Zielsetzung des vorgestellten Projekts befasst sich mit der biochemischen Charakterisierung der generierten Glykolat Dehydrogenasen. Hierbei sollen die Schlüsseleigenschaften wie pH-und Temperaturoptima sowie Km und Vmax mit Glykolat und strukturell ähnlichen Substraten bestimmt werden. Im vierten Projektteil soll die in vivo Aktivität des neu generierten Enzyms in A. thaliana als pflanzlicher Modellorganismus getestet werden, um zu untersuchen ob eine reduzierte Photorespiration durch das artifizielle Enzym erreicht wird.

• DFG-Verfahren: Forschungsstipendien
• Internationaler Bezug: USA
• Gastgeberin: Professorin Frances H. Arnold, Ph.D.