Regulatory mechanisms of KLK proteases from prostate
Final Report Abstract
Die humanen Kallikrein-ähnliche Peptidasen (kallikrein-related peptidases, KLKs) bilden eine Familie extrazellulärer Serinproteasen. Im Rahmen des D-A-CH Projekts "Activity Regulation of Prostatic Proteases" (gemeinsam mit Dr. P. Goettig und Prof. H. Brandstetter der Universität Salzburg; Lead Agency: FWF) beschäftigten wir uns mit den KLKs, die vorwiegend in der Prostata exprimiert werden (KLK2-5 & 11). Einige KLKs, darunter vor allem KLK2 und 4, werden im Prostatakrebs überexprimiert und fördern möglicherweise Tumorwachstum und Metastasierung. Zunächst wurden Prostatakarzinomzellen hergestellt, die jeweils eine der KLKs (2-5 & 11) (über-)exprimieren und die Effekte der Überexpression in zellbiologischen Untersuchungen analysiert. Hierbei stellten wir fest, dass die Überexpression einzelner KLKs - in unterschiedlichem Ausmaß - tumorbiologische Prozesse, wie Proliferation, Migration und Zelladhäsion beeinflusst. Im Fall von KLK4 beobachteten wir bsp. eine Steigerung der Proliferation (auch im 3D-Sphäroidmodell) und der Migration sowie eine erhöhte Adhäsion gegenüber einer Reihe von extrazellulären Matrixproteinen. Weiterführende Untersuchungen mit KLK4-überexprimierenden Zellen ergaben, dass KLK4 als Signalmolekül wirken kann, da es die Genexpression einer Reihe von weiteren tumorassoziierten Genen, darunter COL1A2 (welches für die α2 Kette des Typ I Kollagens kodiert), moduliert. Die KLK4-vermittelte Herunterregulierung von COL1A2 führt möglicherweise zu einer bevorzugten Bildung von homotrimerem α1 Kollagen Typ I, welches - wie von anderen Wissenschaftlern gezeigt - protease-resistente Invasionspfade für invasive Krebszellen bildet, damit eine gerichtete Migration ermöglicht und lokale Proliferation stimuliert. Tatsächlich konnten wir auf mRNA Ebene im Tumorgewebe von Prostatakarzinompatienten eine Erhöhung der KLK4 Expression und eine Erniedrigung der COL1A2 Expression im Vergleich zum angrenzenden Normalgewebe festgestellen. KLK4 moduliert die Aktivität eines weiteren tumorassoziierten proteolytischen Systems, bestehend aus der Serinprotease uPA, ihres Inhibitors PAI-1 und ihres Rezeptors uPAR. Wir untersuchten daher die prognostische Relevanz der mRNA Expression dieser Faktoren beim Prostatakarzinom, konnten aber auf mRNA Ebene keine Assoziation der Faktoren mit dem Gesamtüberleben beobachten. Allerdings waren erhöhte Serumkonzentration vom löslichen uPAR mit einem signikant erhöhten Risiko des Gesamtüberlebens verknüpft (Kooperation mit der Universität Erlangen und TU Dresden). Zusammen mit den D-A-CH Partnern in Salzburg, wurde KLK2 biochemisch und strukturell analysiert. Neben der Untersuchung der Substratspezifität, waren wir besonders interessiert, die strukturelle Basis für die Hemmung des Enzyms durch Zink-Ione aufzuklären. Hierfür wurden mehrere KLK2-Mutanten durch site directed-Mutagenese hergestellt und produziert. Mit diesen Mutanten konnten wir einen KLK4- bzw. KLK3-ähnlichen Hemmmechanismus ausschließen. Vielmehr weisen die Untersuchungen auf die Beteiligung von Glu97 im sogenannten 99-loop, zusammen mit dem His57 der katalytischen Triade, bei der Hemmung durch Zinkione hin. Nachdem der 99-loop auch Zielstruktur für die autolytische Inaktivierung ist (ebenfalls durch Mutationsanalyse nachgewiesen), definieren diese Struktur-/Funktionsanalysen den 99-loop als "Regulator" der enzymatischen Aktivität von KLK2. In weiteren Analysen wurde der Einfluss der Glykosylierung von KLK2 auf u.a. (Auto-)Aktivierung, Autolyse, und Substratspezifität untersucht und deutliche Unterschiede zum nichtglykosylierten Enzym festgestellt. Neben KLK2 wurde auch KLK8 biochemisch und strukturell analysiert. Hier konnte u.a. ebenfalls der Mechanismus der Hemmung des Enzmys durch Zink-Ionen, der sich vom Hemm-Mechanismus von KLK2 unterscheidet, mittels site directed-Mutagense-Studien aufgeklärt werden. Schließlich konnten im Rahmen des Projekts, in einer Kooperation mit der Universität Antwerpen, spezifische Inhibitoren gegen KLK4 identifiziert werden. Derzeit untersuchen wir mit diesen Inhibitoren (aber auch durch Expression verschiedener KLK4-Varianten in Protstata-Karzinomzellen), ob die in Zellkulturexperimenten beobachteten Effekte durch Überexpression von KLK4 auf die enzymatische Aktivität von KLK4 beruhen. In diesem Fall wäre KLK4 eine attraktive Zielstruktur für die Therapie des Prostatakarzinoms.
Publications
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