Control of activity and expression of ion transporters in rat lung: Role of HIF and CREB in hypoxia and beta-adrenergic stimulation
Final Report Abstract
Im vorliegenden Projekt wurde untersucht, ob die Hypoxie- (HIF-1/2α) und cAMP-abhängigen (CREB1/2) Transkriptionsfaktoren an der Hemmung der alveolären Resorption in Hypoxie und deren Stimulation durch β2-adrenerge Substanzen beteiligt sind. Wir führten dazu Experimente an primären Alveolarepithelzellen der Ratte und des Menschen und in-vivo/in-situ Erperimente an narkotisierten Ratten durch. Die Rolle der Transkriptionsfaktoren wurde durch „silencing“ durch Transfektion mit Adenoviren, die Sequenzen zur Expression von spezifischen siRNAs enthielten, untersucht. Nach dem langwierigen Lösen der Probleme mit der durch die Herstellerfirma geänderten Filtermembran „funktionieren“ die Experimente einwandfrei. Wir konnten keinen Effekt von CREB1 und CREB2 auf die Expression von Na-Kanälen und der Na/K-ATPase in Hypoxie und nach β2-adrenerger Stimulation nachweisen. Auch konnten wir entgegen unserer Hypothese keinen Einfluß von HIF- auf CREB-abhängige Reaktionen und umgekehrt nachweisen. Allerdingsfanden wir, dass silencing von HIF-2α, nicht aber HIF-1α, teilweise die Hemmung der Aktivität epithelialer Na-Kanäle (ENaC) und vollständig die Internalisierung von ENaC aufhebt. Dies weist darauf hin, dass HIF-2α die Membranständigkeit von ENaC reguliert. Allerdings stellt dieser Vorgang die Aktivität nicht vollständig wieder her, was darauf hinweist, dass Hypoxie die Offenwahrscheinlichkeit von membranständigen ENaC beeinflußt. Die Mechanismen sind noch nicht bekannt. Diese Ergebnisse sind völlig neu und unerwartet. Völlig anders ist der Effekt von Hypoxie und HIF auf die Na/K-ATPase. In diesem Fall stellt HIF- silencing die in Hypoxie verminderte mRNA Expression wieder her, nicht aber die Aktivität. In-vivo Experimente an der Ratte zeigten, dass nach intratrachealer Applikation von Adenoviren zum Unterdrücken der HIF-Expression auch in vivo HIF-2α silencing die Hemmung der alveolären Resorption in Hypoxie aufhebt ohne die verminderte mRNA Expression zu beeinflussen. Die β2-abhängige Stimulation der alveolären Resorption wird durch HIF-silencing nicht beeinflußt. In primären Alveolarepithelzellen des Menschen führt β2-adrenerge Stimulation zu einer Stimulierung der Resorption, Hypoxie hemmt. Diese Befunde sind qualitativ ähnlich wie bei Zellen aus der Rattenlunge. Inflammation: Inflammation verstärkt die Hypoxie- induzierte Hemmung des Ionentransport und hemmt auch die β2-adrenerge Signaltransduktion. Zusammen zeigen diese Befunde, dass Aktivität und Expression verschiedener membranständiger Ionentransporter und deren Regulation durch β2-adrenerge Substanzen unabhängig von einander reguliert werden. Diese Vorgänge scheinen in Alveolarepithel der Ratte und des Menschen ähnlich abzulaufen. Diese komplexe Regelung des Ionentransports erlaubt eine sehr feiner Dosierung der Resorption und der allgemeinen Zellfunktion in Hypoxie. Daraus ergeben sich möglicherweise verbesserte Behandlungsansätze. Außerdem zeigen unsere Ergebnisse, dass Hypoxie und Inflammation am Alveolarepithel nicht nur die Funktion der alveolären Barriere beeinträchtigen, sondern dass sie sekundäre Effekte in der Lunge auslösen, z.B. eine pulmonale Hypertonie, welche die Ödembildung durch die Resorptionshemmung noch weiter verstärken kann.
