Konfokales Laserscanning-Mikroskop
Final Report Abstract
Das Konfokale Laserscanning Mikroskop wird im Pathologischen Institut von verschiedenen Arbeitsgruppen nahezu ausschließlich für Co-Lokalisationsstudien im Rahmen zahlreicher Forschungsprojekte, die sich im Wesentlichen mit der Pathogenese von Nieren- und Kreislauferkrankungen bzw. immunologischer Erkrankungen beschäftigen, verwendet. Um die Lokalisation bestimmter Antigene exakt bestimmen zu können, werden Schnittpräparate der Niere oder des Herzens bzw. fixierte Zellen aus diesen Organen mit einem für das Antigen spezifischen Antikörper inkubiert. Durch die Verwendung von Antikörpern, die zellspezifische Markerproteine erkennen, können wir charakterisieren in welchen Zellen die bestimmten Antigene nachzuweisen sind. Durch entsprechende Doppelfärbungen, die Zellkompartimente oder zelluläre Substrukturen markieren wie zum Beispiel Mitochondrienmarker, lassen sich auch Aussagen über die ultrastrukturelle Lokalisierung dieser Antigene treffen. Durch den Einsatz von verschiedenen Lasern und entsprechenden Filtern, die nur bestimmte Wellenlängen passieren lassen, ist möglich vier unterschiedliche Antigene mit verschiedenen Fluoreszenz Farbstoffen darzustellen, was für die u.g. Forschungsprojekte sehr hilfreich ist. Die dazugehörige Software ist in der Lage zu bestimmen, in welchen Pixeln des Bildes gleichzeitig verschiedene Fluoreszenzen nachzuweisen sind. Aufnahmen in definierten Schnittebenen erlauben weiterhin die Darstellung von dreidimensionalen Strukturen, wie z.B. Glomeruli, in sogenannten Z-Stapeln. Im Folgenden soll repräsentativ die Verwendung des Konfokalen Laserscanning Mikroskops in zwei wissenschaftlicehn Projekten konkret beschrieben werden: Projekt I: Identifizierung von Molekülen, die an der Repopularisierung des Mesangiums nach Verletzung beteiligt sind. In diesem Projekt wurde die Frage untersucht, welche Moleküle an der Reparatur des Mesangiums nach einer Verletzung dieser glomerulären Perizyten beteiligt sind. Dazu wurde zunächst in Ratten durch die Injektion eines anti-Thy1 Antikörpers das Mesangium komplementvermittelt lysiert und an den Tagen 1, 2, 3 und 5 nach Modellinduktion Glomeruli isoliert, um verschiedene Phasen der Reparatur untersuchen zu können. RNA-Isolationen aus diesen Glomeruli und nachfolgende Analysen mittels Mikroarrays konnten zeigen, dass verschiedene Antigene in diesen Glomeruli während der Reparaturphase, die ab dem Tag 2 beginnt und sich bis zum Tag 5 fortsetzt, verstärkt exprimiert werden. Ein besonders stark hochreguliertes Gen war Transgelin. Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen mit einem Marker für das Mesangium und Transgelin wurden im konfokalen Laser-Scanning Mikroskop untersucht um zu zeigen, dass dieses Molekül tatsächlich von den Mesangiumzellen produziert wurde. Analog wurden solche Untersuchungen auch während der Nierenentwicklung durchgeführt, da Moleküle, die während der Organentwicklung eine Rolle spielen, häufig auch bei Reparaturprozessen erneut exprimiert werden. Dies konnte auch für Transgelin bestätigt werden. In vitro Experimente konnten mit Hilfe der siRNA-Technologie zeigen, dass Transgelin eine Rolle bei der Proliferation und Migration, beides für die Reparaturvorgänge wichtige Prozesse, spielt. Projekt II: Die Rolle von Podozyten als Antigen-präsentierende Zellen. In diesem Projekt wurde im Rahmen eines vom IZKF geförderten Gemeinschaftsprojekt mit der immunmodulatorischen Abteilung der Hautklinik Podozyten, d.h. hochspezialisierte epitheliale Zellen in den Nierenkörperchen, die wesentlich an der Filtration des Blutes beteiligt sind, untersucht. Vorexperimente konnten zeigen, dass diese Zellen auch mit allen Molekülen ausgestattet sind, die zu einer Präsentation von Antigenen bei einer Immunreaktion ausgestattet sind. Solche Immunreaktionen sind bei vielen Nierenerkrankungen wesentlich an der Pathogenese der Erkrankung beteiligt. Nachdem Tiere, denen das MHC II Molekül spezifisch auf der Oberfläche von Podozyten fehlte, weit geringere Veränderungen der Niere nach der Induktion einer experimentellen Glomerulonephritis zeigten, blieb weiterhin unklar, wie eine Aktivierung von T-Zellen durch diese Zellen überhaupt stattfinden kann. In gesunden Nierenkörperchen haben die Podozyten keinen direkten Kontakt zu T-Zellen, da sie durch das Endothel und die Basalmembran von den Entzündungszellen abgeschirmt werden. Mit Hilfe der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie konnten wir zeigen, dass nach Schädigung der Nierenkörperchen durch die Induktion des Glomerulonephritis-Modells das Endothel und die Basalmembran lokal so zerstört werden, dass ein direkter Kontakt von Podozyt und T-Zelle erfolgen kann. Dazu wurde eine Vierfach-Färbung durchgeführt, die zum einen die T-Zellen und zum anderen die Podozyten aber auch durch einen dritten Antikörper die Basalmembran sichtbargemacht hat. Zusätzlich wurden die Zellkerne hier noch mit Hilfe des Farbstoffes DAPI markiert. Projekt III: Die Rolle von knochenmarkstämmigen Zellen bei der kardialen Schädigung während einer chronischen Nierenerkrankung. In diesem Projekt sollte im Rahmen eines vom IZKF geförderten Gemeinschaftsprojektes mit der Med. Klinik 4 (Nephrologie und Hypertensiologie) untersucht werden, ob knochenmarkstämmige Zellen eine Rolle bei der Reparatur oder Schädigung des Herzens bei chronischer Nierenerkrankung haben. Dazu wurde das Knochenmark von transgenen Ratten, die in allen Zellen eine humane plazentale Alkalische Phosphatase exprimieren, in wildtyp Ratten transplantiert, nachdem deren eigenes Knochenmark durch Bestrahlung zerstört worden war. Sechs Wochen später wurde bei den Tiere mittels subtotaler Nephrektomie eine chronische Niereninsuffizienz induziert und weitere 12 Wochen später wurden die durch die Nierenerkrankung geschädigten Herzen mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie untersucht. In Immunfluoreszenz-Doppelfärbungen wurde mit Hilfe von Markern für z.B. Endothelzellen oder Entzündungszellen gezeigt, dass nahezu alle knochenmarkstämmige Zellen Entzündungszellen sind und nur sehr wenige z.B. in Endothelzellen differenzieren.
Publications
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Transgelin is a marker of repopulating mesangial cells after injury and promotes their proliferation and migration. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology 92: 812-826, 2012
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HIF-1alpha activation results in actin cytoskeleton reorganization and modulation of Rac-1 signaling in endothelial cells. Cell communication and signaling : CCS 11: 80, 2013
Weidemann A, Breyer J, Rehm M, Eckardt KU, Daniel C, Cicha I, Giehl K, and Goppelt-Struebe M
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Podocytes are nonhematopoietic professional antigen-presenting cells. Journal of the American Society of Nephrology : JASN 24: 906-916, 2013
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PML-nuclear bodies decrease with age and their stress response is impaired in aged individuals. BMC geriatrics 14: 42, 2014
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