Biocatalytic Redox Cascades Using Baeyer-Villiger-Monooxygenasen
Final Report Abstract
Der Zellmetabolismus besteht aus einem effektiven System an Enzymkaskaden, um das Leben zu ermöglichen. Hier werden Stoffe ohne Aufarbeitung über verschiedene Intermediate selektiv zum Produkt umgesetzt. Die Ersparnis an Zeit, Kosten und Abfall durch den Wegfall von Reinigungen der Zwischenprodukte und der direkte Umsatz von toxischen oder instabilen Intermediaten zum Produkt machen Kaskadenreaktionen zu einem aktuellen und interessanten Anwendungsbereich der Biotechnologie. Im Rahmen dieses Projektes in Zusammenarbeit mit der TU Wien konnte erstmalig eine in vivo Enzymkaskade bestehend aus drei Oxidoreduktasen zur Darstellung optisch aktiver Laktone via Desymmetrisierung bzw. enantiokonvergenter Reaktionen für die organische Synthese erfolgreich etabliert werden. Für diese in vivo Enzymkaskade bestehend aus ADH, Enoatreduktase und BVMO konnte eine ganze Reihe geeigneter Enzyme identifiziert und funktionell in E. coli hergestellt werden. Mit zwei komplementär selektiven ADHs konnte eine Oxidation von chiralen Cyclohexenol-Derivaten und Carveolen zu den entsprechenden prochiralen Ketonen erfolgen. Drei neue Enoatreduktasen aus P. putida ATCC 17453, die sowohl aliphatische als auch cyclische Ketone und Aldehyde akzeptieren, konnten ebenfalls identifiziert und umfassend biochemisch charakterisiert werden. In der Kaskade zeigen XenA und XenB exzellente Stereoselektivitäten. Nach umfangreichen molekularbiologischen Arbeiten gelang es alle Enzymkombinationen für die Kaskade löslich und aktiv in einem E. coli-Stamm zu exprimieren. Mit der Kombination verschiedener nicht-natürlich verbundener Biokatalysatoren konnten in vivo Cyclohexenol und einfach Methylsubstituierte Cyclohexenol-Derivate selektiv zu chiralen Laktonen umgesetzt werden. Durch den modularen Aufbau kann die Kaskade flexibel an verschiedene Substrate und Stereopräferenzen angepasst werden. Die Umsatzgeschwindigkeit konnte mit Hilfe von Fusionsproteinen aus XenB und CHMO nochmals gesteigert werden. Durch die Anwendung einer Mischkultur aus R. equi und E. coli mit der synthetischen Enzymkaskade war die Umsetzung von Limonen zu den gewünschten Dihydrocarvonlaktonen möglich. Folglich konnten alle Ziele des Vorhabens erreicht und die Etablierung einer modularen in vivo Enzymkaskade für die Herstellung chiraler Laktone gezeigt werden.
Publications
- 2012: Discovery, application and protein engineering of Baeyer–Villiger monooxygenases for organic synthesis, Org Biomol Chem 10:6249-6265
K. Balke, M. Kadow, H. Mallin, S. Saß, U. T. Bornscheuer
(See online at https://doi.org/10.1039/c2ob25704a) - 2013: An enzymatic toolbox for cascade reactions: a showcase for an in vivo redox sequence in asymmetric synthesis, ChemCatChem 5(12):3524-3528
N. Oberleitner, C. Peters, J. Muschiol, M. Kadow, S. Saß, T. Bayer, P. Schaaf, N. Iqbal, F. Rudroff, M. D. Mihovilovic, U. T. Bornscheuer
(See online at https://doi.org/10.1002/cctc.201300604) - 2013: Efficient biocatalysis with immobilized enzymes or encapsulated whole cell microorganism by using the SpinChem reactor system, ChemCatChem 5(12):3529-3532
H. Mallin, J. Muschiol, E. Byström, U. T. Bornscheuer
(See online at https://doi.org/10.1002/cctc.201300599) - 2014: Functional assembly of camphor converting two-component Baeyer-Villiger monooxyygenases with a flavin reductase from E. coli, Appl Microbiol Biotechnol, 98:3975-3986
Kadow, M., Balke, K., Willetts, A., Bornscheuer, U. T., Bäckvall, J. E.
(See online at https://doi.org/10.1007/s00253-013-5338-3) - 2014: Identification, characterization, and application of three enoate reductases from Pseudomonas putida in in vitro enzyme cascade reactions, ChemCatChem 6(4):1021-1027
C. Peters, R. Kölzsch, M. Kadow, L. Skalden, F. Rudroff, M. D. Mihovilovic, U. T. Bornscheuer
(See online at https://doi.org/10.1002/cctc.201300957) - 2014: In vitro characterization of an enzymatic redox cascade composed of an alcohol dehydrogenase, an enoate reductases and a Baeyer-Villiger monooxygenase, J Biotechnol 192 (Part B):393-399
N. Oberleitner, C. Peters, F. Rudroff, U. T. Bornscheuer, M. D. Mihovilovic
(See online at https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2014.04.008) - 2015: A three enzyme mediated redox cascade for the production of normal carvo-lactone, in Practical Methods for Biocatalysis and Biotransformations 3, Vol. 3 (Hrsg. J. Whittall, P. W. Sutton, W. Kroutil)
N. Oberleitner, C. Peters, J. Muschiol, F. Rudroff, M. D. Mihovilovic, U. T. Bornscheuer
- 2015: Cascade catalysis – strategies and challenges en route to preparative synthetic biology, Chem Commun 51:5798-5811
J. Muschiol, C. Peters, N. Oberleitner, M. D. Mihovilovic, U. T. Bornscheuer, F. Rudroff
(See online at https://doi.org/10.1039/c4cc08752f)
