Zellanalyse- und Hochgeschwindigkeitssortiersystem
Final Report Abstract
Die Arbeitsgruppe von Herrn Stephan Kissler erforschte die immunologischen Grundlagen des Diabetes Typ I. Zu diesem Zweck wurden neue transgene Mäuse generiert, in denen bestimmte Gene durch RNA Interferenz ausgeschaltet sind. In diesen Mäusen wurden verschiedene Immunzellen auf veränderte Merkmale oder Funktionen untersucht. Zur Charakterisierung einzelner Immunzelltypen wurde die Durchflusszytometrie eingesetzt. Immunzellen wurden auch per Durchfluszytometrie sortiert und in Transplantationsexperimente eingesetzt, wofür das Zellsortiergerät unentbehrlich war. Die Arbeitsgruppe von Frau Alma Zernecke befasste sich mit der Erforschung der Pathomechanismen der Atherosklerose. Neben Monozyten/Makrophagen, die den größten Anteil der Zellen in atherosklerotischen Plaques ausmachen, können auch Lymphozyten und dendritische Zellen in atherosklerotischen Läsionen detektiert werden, und es ist mittlerweile gut etabliert, dass das Immunsystem eine wichtige Rolle in der Atherogenese spielt. Die Arbeitsgruppe befasste sich insbesondere mit dem differentiellen Beitrag von Immunzellen und deren Regulation durch microRNAs. So beschäftigte sich Frau Zernecke mit der Charakterisierung einer Subpopulation von klassischen dendritischen Zellen, die sich durch Sekretion des Chemokins CCL17 auszeichnen. Diese Zellen wurden nach Sortierung in Microarrays charakterisiert. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass diese Zellpopulation wichtige proatherogene Funktionen ausübt. Weiter wurde die Population von plasmazytoiden dendritischen Zellen genauer charakterisiert, die sich durch die Sekretion von Interferon-α auszeichnen, aber auch antigen-abhängig mit T-Zellen interagieren können, und ebenfalls die Atherosklerose vorantreiben. Weiter hat Frau Zernecke sich mit dem microRNA Profil von sortierten Monozytensubsets im Vergleich zu dem microRNA Profil von humanen atherosklerotischen Plaques beschäftigt, und konnten hier interessante Parallelen aufzeigen, die auf eine mögliche Rekrutierung von Monoyztensubsets in den Plaque hindeuten könnten. Zudem wurde das Chemokinrepertoir untersucht, welches von unterschiedlichen Monozytensubsets benutzt wird, um in atherosklerotisch aktivierte Gefäße zu rekrutieren. In noch nicht veröffentlichen Arbeiten hat sich die Arbeitsgruppe mit der Expression und Funktion von microRNAs in dendritischen Zellen sowie mit der Rolle unterschiedlicher T-Zellpopulationen bei der Atherosklerose beschäftigt. Der Schwerpunkt in der Forschung in der Arbeitsgruppe Prof. Jörg Vogel am Institut für Molekulare Infektionsbiologie liegt in der funktionellen Charakterisierung von sRNAs mit Hinblick auf die bakterielle Virulenz und die Wechselwirkung pathogener Bakterien mit den befallenen Wirtszellen. Neben bakteriellen RNAs, die für die Interaktion mit dem Wirt wichtig sein könnten, sind wir auch an microRNAs auf der eukaryontischen Seite interessiert. Die Studie, durchgeführt von Dr. Leon Schulte, untersuchte die Regulierung von microRNAs in eukaryontischen Wirtszellen nach Infektion mit Salmonella Typhimurium. Verwendet wurden murine Macrophagen. Zur Differenzierung wurden die Wirtszellen mit dem Zellsortiergerät sortiert und analysiert. In murinen Macrophagen bewirkt die bakterielle Induktion durch Salmonella eine Hochregulierung von NF-kB assoziierten microRNAs. Erstaunlich ist dabei, dass diese unabhängig von Invasion und Replikation erfolgt. Die Resultate zeigen, dass microRNAs eine große Rolle schon zum Beginn der Infektion spielen. Außerdem ist die microRNA-Reaktion auch abhängig von dem Status der infizierten Zellen. In dieser Studie wurde die microRNA Gruppe let-7 als Hauptregulator der zellbasierten Immunantwort identifiziert. Thrombozytenaktivierung und -aggregation sind zentrale Schritte in der normalen Hämostase, aber auch wichtige Pathomechanismen bei der Entstehung von Infarkten und Embolien, die weltweit eine Haupttodesursache darstellen. Am Lehrstuhl für Experimentelle Biomedizin (Universitätsklinikum und Rudolf-Virchow-Zentrum) befassen sich mehrere Gruppen mit der Funktion von Thrombozyten in Hämostase, Thrombose und Entzündung sowie den Mechanismen ihrer Entstehung im Knochenmark. In der Arbeitsgruppe von Herrn Bernhard Nieswandt und Herrn Harald Schulze wurde das Gerät vor allem für die Sortierung von seltenen hämatopoetischen Zellen verwendet. Insbesondere wurden Megakaryozyten (MKs) aus dem Knochenmark der Maus sortiert. Hierzu wurde das Mark eines Femurknochens ausgespült und mit linienspezifischen Antikörpern markiert. Durch eine kombinierte Gate-Setzung aus FSC/SSC und Fluoreszenzmarkern können MKs spezifisch isoliert und weiter kultiviert oder isoliert werden. Eine alternative Anreicherung (Dichtegradienten oder MACS) ist in diesem Ansatz nicht möglich. Weiter erfolgte die Sortieren von transfizierten oder transduzierten Zellen. Mit GFP transfizierte Zellinien können so auch bei geringer Transfektionsrate angereichert werden. Primäre hämatopoetische Stammzellen aus der Maus (fetale Leberzellen oder LSK-Zellen aus Knochenmark) oder dem Menschen (CD34-positive Zellen) wurden mit retroviralen Vektoren infiziert, die als Marker GFP oder mCherry exprimieren. Damit konnten infizierte von nicht-infizierten Stammzellen getrennt werden. Diese Methode ist elegant, da sie eine interne Kontrolle (Gleichbehandlung der Zellen) darstellt. Positive und negative Zellen wurden gesammelt und für weiterführende Experimente re-kultiviert. In einem gemeinsamen Projekt der Gruppen um Andreas Beilhack und Katrin Heinze wurde das Gerät verwendet, um definierte T-Zellen-Subpopulationen und genetisch markierte Tumorzellen zu sortieren. Die durchflusszytomtrische Aufreinigung der Zellen war ein wesentlicher Schritt, um eine neue Mikroskopietechnologie zu validieren. die Migrattionseigenschaften von definierten CD4+ T- Zellen in verschiedene Organe wurde nach hämatopoietischer Stammzelltransplantation im Mausmodell untersucht. Ziel der Arbeit war die Kartierung von Immunprozessen in intakten Geweben mit zellulärer Auflösung (Brede et al., JCI 2012). In einem weiteren Projekt wurden genetisch definierte regulatorische T Lymphozyten durchflusszytometrisch aufgereinigt, um diese anschließend in vivo zu untersuchen. Die genetisch markierten und mittels Durchflusszytometrie subklonierten Tumorzellen wurden in verschiedenen Projekten eingesetzt, um die Proliferation, die Metastasierung und das Therapieansprechen mittels nicht-invasiver Biolumineszenzbildgebung zu visualisieren und zu quantifizieren.
Publications
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