Aktivitätsabhängige pH-Veränderungen in prinzipalen Neuronen und in Astrozyten des Hippokampus der Maus
Final Report Abstract
Zweck und Ziel des Projekts war es, subzelluläre pH-Veränderungen durch hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. Im besten Fall sollten die Life-Aufnahmen mit Elektrophysiologie gekoppelt oder getrennt voneinander untersucht werden. Die vorzuweisenden Resultate konnten für die cytosolische Carboanhydrase (CAII) und den Natrium-Protonen-Transporter NHE1 durch Kombination aus molekularbiologischen Methoden (immunhistochemische Untersuchungen, Co-Immunpräzipitation, Ultrazentrifugation zur Separation von synaptosomatischem Material) und Weitfeld-Fluoreszensimaging in Astrozytenkultur unter Verwendung verschiedener Inhibitoren folgendes zeigen: CAII und NHE1 sind beide in Wildtyp-Astrozyten im Mausehippokamupus exprimiert und kolokalisiert (Immunfluoreszez, Synaptosomen-Zentrifugation), binden aber nicht stabil nachweisbar (CoIP). Physiologisch interagieren die beiden Proteine, um die intrazelluläre H+-Homöostase nach Glutamataufnahme schnellstmöglich wieder herzustellen. Ist CAII nicht vorhanden (WT/KO) oder gleichzeitig mit dem NHE1 geblockt (AZA + Cimetidin) haben die astrozytären Ausläufer weniger Kapazität den Säureschub, der gleichzeitig mit Glutamat einströmt abzufangen. Ansonsten ergab sich für Glutamat eine signifikant schnellere pH-Veränderung in den astrozytären Somata im Vergleich zu den Ausläufern, deutlich höhere (signifikant) Pufferkapazität in den Ausläufern im Vergleich zu Somata, woraus rein rechnerisch folgte, dass die Transportvermittelten H+-Fluxe deutlich rascher in der Peripherie im Vergleich zu Somata von statten gehen. Es trat in einer Subpopulation von Astrozyten eine andere Protonen-Transportrichtung auf, woraus wir folgerten, dass es auf unterschiedliche Transporterexpression, zumindest in kultivierten Astrozyten, zurückzuführen ist. Ferner sind Einzelergebnisse entstanden, denen der Bogen bzw. die Vollständigkeit zur Verknüpfung fehlt, so z.B. die Monokarboxylattransporter. MCT1 war in Neuronen, schwach in Astrozyten und sehr prominent in Blutbahnen nachweisbar. MCT2 war in adulten Mäusen in den Zellkörpern der hippokampalen Pyramidenzellen vorhanden, es gelang jedoch nicht ihn im Blot reproduzierbar sichtbar zu machen. Er band keine CAII, dafür interagierte er scheinbar mit dem NHE5 (CoIP). Die qPCR könnte ein Hinweis sein, dass das Protein in Neuronen von CAII-KO- Tieren im Vergleich zum WT-Gewebe hoch-exprimiert wird um ein Fehlen des Protonenkatalytischen Enzyms zu kompensieren. ASIC war hauptsächlich in Somata der Pyramidenzellen und auch in der Synaptosomenfraktion nachweisbar. NHE5 kolokalisiert im Hirnschnitt mit ASIC, MCT1, MCT2 und NHE1 in Pyramidenneuronen und fördert durch H+- Auswärtstransport vermutlich die Laktataufnahme. Die qPCR weist auf erhöhte Expression in CAII-KO-Gewebe hin, sowohl für NHE5 als auch für NHE1.
