Das autonom zellgängige bakterielle Effektorprotein YopM als neues biologisches Therapeutikum der rheumatoiden Arthritis
Final Report Abstract
Das Protein YopM ist ein Effektorprotein Gram-negativer Yersinien. In Vorarbeiten zu diesem Antrag konnten wir zeigen, dass rekombinant exprimiertes YopM selbstständig und unabhängig von zusätzlichen bakteriellen Faktoren (’autonom’) in eukaryotische Zellen einzudringen vermag, die Transkription proinflammatorischer Zytokine wie z. B. TNFα vermindern kann und in Knochenmarksmakrophagen die RANKL-induzierte Osteoklastogenese aus BMM inhibiert. Aufbauend auf diesen Daten wollten wir in dem vorliegenden Projekt die zugrunde liegenden Mechanismen der anti-inflammatorischen und antiosteoklastogenen Eigenschaften von YopM analysieren und so die Entwicklung von YopM basierten Ansätze zur Behandlung der RA vorantreiben. Wir konnten zeigen, dass YopM in der Lage ist, verschiedene synoviale Zellen, insbesondere synoviale Fibroblasten und Monozyten/Makrophagen zu penetrieren und in diesen Zellen sowohl in vitro als auch in vivo zu einer verminderten Expression von Effektormolekülen sowie zu einer verminderten Osteoklastogenese beizutragen. In vivo führt die Applikation von YopM in die Hinterpfoten arthritischer TNF-transgener Mäuse zu einer Verminderung der klinischen Schwere der Erkrankung. Zudem kommt es zu einer meßbaren Verringerung des histologisch bestimmbaren Gelenkschadens über eine verminderte in vivo Expression matrixzerstörender Enzyme wie MMP-3 sowie über eine vermindeter Osteoklastogenese. Um die molekularen Mechanismen der durch YopM induzierten Immunsupression besser zu verstehen, wurde in einem parallelen Aspekt dieses Vorhabens von Frau Sabrina Höfling untersucht, welche Signalwege und Zellkompartimente durch YopM moduliert werden. YopM aktiviert Makrophagen und verstärkt die Endozytose, durch die es in die Zelle aufgenommen wird. Nach der autonomen Translokation verlangsamt YopM die Reifung des endo-/lysosomalen Kompartiments. Dadurch könnte das Protein seine Translokation ins Zytosol durch einen endosomal escape, basierend auf einem bisher unbekannten Mechanismus, induzieren. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Inhibition der Differenzierung von Makrophagen zu Osteoklasten durch YopM entgegen der Erwartung vermutlich nicht durch eine verminderte Phosphorylierung von NF-κB p65 bedingt ist. Womöglich spielen andere intrazelluläre Signaltransduktionskaskaden eine Rolle oder die Wirkung könnte in vivo auf einem indirekten, durch RA- Synovialfibroblasten-vermittelten, Effekt beruhen. Auch die Regulation der Zytokin-Expression durch eine inhibierende Wirkung von YopM auf die NF-κB-Signaltransduktionskaskade konnte weitgehend ausgeschlossen werden. Interessanterweise konnten wir zeigen, dass der anti-inflammatorische Effekt von YopM nicht durch die Interaktion mit den Wirtszellkinasen RSK1 und PRK2 vermittelt wird. Interaktionsstudien unter Verwendung verschiedener YopM-Deletionskonstrukte ergaben, dass die mittlere LRR-Region von YopM (LRRs 4 - 9) essentiell zur Hyperaktivierung von RSK1 beiträgt. Ein YopM-Deletionskonstrukt, welches keinen Effekt auf die Zytokin-Expression ausübt, sorgte dennoch für die Hyperaktivierung von RSK1. Im Gegensatz dazu wiesen andere Konstrukte, die die Expression proinflammatorischer Zytokine in gleichem Maß inhibieren wie das vollständige YopM, einen deutlich reduzierten Effekt auf die Aktivierung von RSK1 auf. Demnach scheint YopM seine intrazelluläre Funktion durch vielfältige und zum Teil auch voneinander unabhängige Effekte auszuüben. Die Rolle des trimeren YopM/RSK/PRK-Komplexes für die Wirkung von YopM nach autonomer Zellpenetration oder während einer Infektion ist bis heute ungeklärt. Da die Bindung einer nachgeschalteten Kinase an RSK1 ebenfalls nicht durch die YopM/Kinase-Interaktion beeinflusst wurde, ist davon auszugehen, dass keine induzierte Aktivierung physiologischer Substrate stattfindet. Vielmehr kann angenommen werden, dass YopM die Wirtszellkinasen zur Aktivierung anderer, nicht-physiologischer Substrate nutzt, um seine intrazelluläre Funktion auszuführen. Im Hinblick auf die Anwendung von YopM als Therapeutikum konnten in Studien mit dem synovialen targeting tag HAP1 als Fusionsprotein mit YopM erste Hinweise auf eine potentielle auf das Synovium zielgerichtete Anwendung von YopM gewonnen werden. HAP1-YopM könnte die orale oder intravenöse Applikation von YopM mit dennoch hoher Wirkungseffizienz und geringen Nebenwirkungen ermöglichen. Die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse liefern einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der molekularen Wirkungsweise von YopM nach autonomer Translokation und liefern damit auch eine Basis für eine potentielle Anwendung als immunmodulatorisches Therapeutikum, z. B. gegen Autoimmunerkrankungen.
Publications
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(2014) Dissertation; Westfälische Wilhelms-Universität Münster, Das autonom zellgängige bakterielle Effektorprotein YopM im Modell der rheumatoiden Arthritis
Höfling, S.
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(2014) Manipulation of pro-inflammatory cytokine production by the bacterial cell-penetrating effector protein 1 YopM is independent of its interaction with host cell kinases RSK1 and PRK2. Virulence, 5(7), 761-771
Höfling, S., Scharnert, J., Cromme, C., Bertrand, J., Pap, T., Schmidt, M. A., and Rüter, C.
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(2015) Dissertation; Westfälische Wilhelms-Universität Münster, The Effects of YopM on Inflammatory Polyarthritis
Cromme, C.
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2015) Current activities of the Yersinia effector protein YopM. Int. J. Med. Microbiol.; 305, 424-432
Höfling, S., Grabowski, B., Norkowski, S., Schmidt, M. A. and Rüter, C.
