Structure investigations of export competent messenger ribonucleoproteins
Final Report Abstract
Ziel des Projekts war die Untersuchung des Lokalisationsmechanismus von mRNAs. Das zu untersuchende System war das „Lokasom“ der Hefe S. cerevisiae, welches eine Reihe von mRNAs in knospender Hefe (budding yeast) zur Knospungsspitze (bud tip) transportiert. Dieses besteht im Kern aus der zu lokalisierenden mRNA die verschiedene Lokalisierungssignale enthält, des RNA bindenden Proteins She2p, des Adaptorproteins She3p und des Motorproteins Myo4p. Mittels Röntgenstrukturanalyse sollte die Struktur des Komplexes aus dem Lokalisationssignal der mRNA und dem Protein She2p bestimmt werden. Während des Projektes konnten mittels in vivo Expression der RNA in E. coli hinreichend grosse und homogene Mengen aufgereinigter RNA hergestellt werden, die zur Bestimmung der Minimallokalisierungssequenz eingesetzt wurden. Diese besteht aus 42 Basen, weitere Verkürzungen führen zu einem Verlust der Bindung des Proteins an die RNA. Weiterhin konnte mittels Dynamischer Lichtstreuung die Stöchiometrie des mRNP Komplexes aus E2A RNA und She2p bestimmt werden. Dabei wurde gezeigt, dass vier She2p Proteine jeweils ein mRNA Erkennungssignal binden. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, dass das Hinzufügen des Adapterproteins She3p zum mRNP Komplex einen stablisierenden Effekt auf diesen ausübt. Die Komplexe aus E2A RNA und She2p, sowie E2A RNA, She2p und She3p-Fragmenten konnten nach einem weiteren Aufreinigungsschritt nach der Rekonstitution der Komplexe reproduzierbar kristallisiert werden. Allerdings lieferte keiner dieser Komplexe in Streuexperimenten hinreichende Diffraktionsdaten für eine weitergehende Strukturbestimmung. Weiterführende Experimente mit grösseren Komplexen unter Einbeziehung anderer Proteine des Lokasoms werden durchgeführt und könnten zu erfolgreichen Strukturuntersuchungen führen.
