Investigation of a soluble DNA translocase
Final Report Abstract
Die DNA Translokase SftA ist eine DNA abhängige ATPase. SftA bindet an die Zellteilungsebene, in Abhängigkeit von FtsZ, und kann DNA, die während der Ausbildung des Teilungsseptums noch in der Zellmitte verbleibt, in die neuen Tochterzellen verteilen, bis das Septum verschlossen ist. Hernach kann nur das Membranprotein SpoIIIE DNA, die in der Membran/Zellwand eingeschlossen ist, in die Tochterzellen pumpen. Wie SpoIIIE bildet SftA Hexamere aus, die um einen DNA Doppelstrang herum binden, und ATP getrieben sich auf der DNA bewegen, bzw. DNA translozieren, wenn die Proteine verankert sind. SftA und SpoIIIE sind also ein zweistufiges „Rettungssystem“, das bei einem Fehler bei der Chromosomensegregation nicht-verteilte DNA bewegt. Das Ziel des Antrags war es, die DNA-Bindeaktivität und den DNA- Translokationsmechanismus von SftA besser zu verstehen. Weiterhin sollte geklärt werden, wodurch SftA zum Zellmitte an den FtsZ Ring rekrutiert wird, und ob SftA ein Membran-assoziiertes Protein ist, oder komplett löslich in der Zelle vorliegt, neben der Septum-gebundenen Fraktion. Für SpoIIIE sollte geklärt werden, ob es zum FtsZ Ring rekrutiert wird, oder lediglich in der Membran diffundiert, ohne spezifischen Bindepartner. SftA ist in der Zelle ein lösliches Protein, und nicht membranassoziiert, wie SpoIIIE. Ein Bereich von Aminosäure 20 bis 64 ist für die Rekrutierung notwendig und ausreichend. Selbst eine geringe Induktion von verkürzten SftA Untereinheiten inhibiert die Funktion des Proteins, was nahelegt, dass die Hexamere von SftA keine inaktive Untereinheit tolerieren. SftA bindet demnach an ein Protein der Zellteilungsmaschinerie, u.a. an FtsA, mit einem Bereich im N-Terminus, und formiert dort Hexamere, die ggf. an DNA binden und diese bewegen. SftA bindet kooperativ an DNA in vitro, in Übereinstimmung mit der DNA-unabhängigen Hexamerisierung. Ein Hexamer muss sich dementsprechend lateral öffnen, um an DNA zu binden. Durch single molecule tracking (SMT) konnten wir zeigen, dass über 70% der SftA Monomere als Hexamere am Septum gebunden sind, und knapp 30% durch das Zytosol diffundieren. Nach der Depletion von FtsA, welches als Membran-Anker von FtsZ fungiert, war SftA deutlich mobiler und zu einem geringeren Anteil am Septum statisch lokalisiert. FtsA konnte SftA in Schneider S2 Zellen aus Drosophila an die Zellmembran rekrutieren, wobei SftA alleine nur zytosolisch verteilt. Diese Daten zeigen durch zellbiologische Techniken, dass SftA löslich ist, und dass FtsA auch als Anker für SftA am Teilungsseptum fungiert, und demnach eine duale Funktion ausübt. In Deletionsmutanten von frühen Zellteilungsgenen war SftA nur in Abwesenheit von FtsZ und nach der Depletion von FtsA fehlerhaft lokalisiert, kein anderes bekanntes Protein hatte einen Effekt auf die Rekrutierung von SftA. Im Gegensatz zu SftA diffundierte das Enzym PfkA durch die Zellen ohne statisch verankerte Fraktione, und SpoIIIE bewegte sich diffusiv in der Zellmembran, ohne sichtbare Akkumulation am Teilungsseptum. Diese Arbeiten zeigen, dass SpoIIIE und SftA prinzipiell ganz unterschiedliche Bewegungsmuster besitzen: SpoIIIE ist stets auf der Suche nach Membraneingeschlossener DNA, wohingegen SftA am Septum spezifisch angelagert wird. Durch SMT kann man Diffusions – und Bindungskinetiken von Proteinen in lebenden Zellen zu bestimmen, wohingegen die mobile Fraktion von Proteinen durch konventionelle Fluoreszenzmikroskopie nicht detektierbar ist.
Publications
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(2018) Single-Molecule Tracking of DNA Translocases in Bacillus subtilis Reveals Strikingly Different Dynamics of SftA, SpoIIIE, and FtsA. Applied and environmental microbiology 84 (8)
El Najjar, Nina; El Andari, Jihad; Kaimer, Christine; Fritz, Georg; Rösch, Thomas C.; Graumann, Peter L.
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Requirements for Septal Localization and Chromosome Segregation Activity of the DNA Translocase SftA from Bacillus subtilis. (2017) J Mol Microbiol Biotechnol 2017;27:29–42
Nina El Najjar, Christine Kaimer, Thomas Rösch, Peter L. Graumann
