Automatisiertes "high content" Screening Fluoreszenzmikroskop
Final Report Abstract
Zellen regulieren die Menge und Verteilung von Proteinen mit hoher Präzision, und um Zellen und ihre Funktionsweise zu verstehen, muss die komplexe Organisation, welche viele tausend Proteine umfasst, genau studiert und vermessen werden. Zu diesem Zwecke werden sogenannte Hoch- Durchsatz Mikroskope verwendet, welche in der Lage sind viele tausend Proben detailliert und mit hoher Geschwindigkeit und einer Auflösung von 200 – 300 nm zu fotografieren und jeweils einzelne Protein sichtbar zu machen. Damit die Mikroskope diese Proteine auch sehen, machen wir Gebrauch von sogenannten fluoreszierenden Proteinen, welche für diese Anwendungen einzeln an die verschiedenen Gene einer Zelle angekoppelt werden, sodass die daraufhin produzierten Proteine sichtbar gemacht werden können. Im Rahmen eines solchen Projektes müssen häufig zig-tausende an Bilder ausgewertet werden um die Verteilung der Protein zu erfassen und um zu verstehen, wie sich diese Verteilung ändert, z.B. wenn die Zelle unter Stress gerät. Insbesondere dieser letzte Punkt, wie verhalten sich Proteine unter Stressbedingungen ist eine der Hauptfragestellungen des Sonderforschungsbereiches (SFB) 1036 der DFG. So wurde im Rahmen dieses Forschungsverbundes das Mikroskop z.B. dazu benutzt um zu untersuchen, was passiert wenn die Zellen einer chronischen Stress Situation oder einer unnatürlich hohen Temperatur ausgesetzt werden, z.B. 42°C, wie es ja auch bei Fieber in extremen Situationen der Fall sein kann. Man beobachtete dann dass es viele Proteine gibt, die auf diese Situation reagieren und z.B. durch teilweise oder ganze Entfaltung ihrer Struktur zusammenklumpen und daher ihre Funktion nicht mehr ausüben können. Nun gibt es aber zelluläre Systeme, die genau für solche Situationen geschaffen sind, und die versuchen, diese Proteine wieder in ihren originalen Zustand zurück zu falten, oder, wenn dies nicht möglich ist, zu entsorgen durch sogenannte Proteolyse, das heißt, die Proteine werden verdaut. In einem anderen Projekt wurde das Mikroskop verwendet, um zu schauen wie sogenannte nicht kodierende RNA Moleküle, also Moleküle die nicht direkt bei der Proteinsynthese beteiligt sind, trotzdem irgendwie die Proteinproduktion verändern und beeinflussen können. Auch in diesem DFG finanzierten Projekt wurden viele 1000 Proben untersucht, jetzt mit dem Zwecke, gezielt die Funktion von vielen verschiedenen nicht kodierenden RNAs zu untersuchen. Des weiteren wurde und wird das Nikon Gerät versendet, um Methoden und Software zu entwickeln, welche notwendig ist für die quantitative Analyse von Fluoreszenzmikroskopibildern. Anhand des Nikon Mikroskopes wurde z.B. die Software PSFj verwendet, welche es erlaubt, typische Artefakte von Fluoreszenzmikroskopen, wie chromatische Aberrationen, ungleichmäßige Ausleuchtung, etc. quantitativ zu erfassen um diese bei der Bildanalyse zu berücksichtigen (http://www.knoplab.de/psfj/).
Publications
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Protein Abundance Control by Non-coding Antisense Transcription. Cell Rep 15, 2625–2636
F. Huber, D. Bunina, I. Gupta, A. Khmelinskii, M. Meurer, P. Theer, L. M. Steinmetz, and M. Knop
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PSFj: know your fluorescence microscope. Nature Methods (2014), 11, 981-982
P. Theer, C. Mongis & M. Knop
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Systemic control of protein synthesis through sequestration of translation and ribosome biogenesis factors during severe heat stress. FEBS Lett. 589, 3654–3664
V. Cherkasov, T. Grousl, P. Theer, Y. Vainshtein, Ch. Gläßer, C. Mongis, G. Kramer, G. Stoecklin, M. Knop, A. Mogk, B. Bukau
