Integrierte Impedanzspektroskopie für das biotechnologische Massenscreening aerober Zellkulturen
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das Ziel dieses Forschungsprojektes war es, eine impedanzbasierte Online-Sensorik zu entwickeln und zu charakterisieren, mit der man in Mikrobioreaktoren wichtige Informationen über das biologische Reaktionssystem gewinnen kann. Hierzu sollte der Frequenzbereich der biologischen ß-Dispersion von 100 kHz bis 10 MHz verwendet werden. Als Basis für alle zu entwickelnden Elektroden diente eine 96-er Mikrotiterplatte (MTP). Die Arbeit unterteilte sich hierzu in folgende Arbeitspakete: Die Hauptaufgabe im ersten Teil der Arbeit war die grundsätzliche Entwicklung eines galvanisch entkoppelten Impedanzmessverfahrens. Hierzu wurden auf zirka 5 μm dünnen Polyimidfolien verschiedene Goldelektroden hergestellt, die in einem späteren Prozessschritt unter einer 96-er Mikrotiterplatte fixiert werden konnten. Es wurden fünf verschiedene Elektrodendesigns entworfen und aufgebaut. Zusätzlich wurden flexible Sensoranordnungen hergestellt, die durch Faltung eine Integration in die Seitenwand von MTP-Wannen ermöglichte. Ein Schwerpunkt war die Charakterisierung der Einflüsse der polymeren Isolationsmaterialien Polyimid und Parylene auf die durchgeführten Messungen. Hierfür war es erforderlich, neue Modelle zur analytischen oder numerischen Beschreibung der aufgebauten Sensoren zu entwickeln und anhand von Versuchen zu verifizieren. Weitere Versuche mit Indium-Zinnoxid (ITO) sollten die Anwendbarkeit dieses transparenten Leitermaterials als Elektrode für die galvanisch entkoppelten Sensoren nachweisen. Der Einsatz transparenter Elektrodenmaterialien würde einen optischen Zugang durch den elektrisch funktionellen Boden der MTPs erlauben. Verschiedene Sensoren wurden nach dem Prinzip der Vierpunktmessung entwickelt und aufgebaut. Das Verfahren der Vierpunktmessung zur Analyse komplexer elektrischer Eigenschaften flüssiger Lösungen wurde bezüglich unterschiedlicher Designs und Elektrodenmaterialien untersucht. Auch für dieses Arbeitspaket wurden fünf verschiedene Bodensensordesigns und ein seitenwandintegriertes Design entwickelt. Es wurde durch numerische Simulationen und entsprechender Kontrollmessungen der Einsatz für die Beobachtung speziell aerober Zellkulturen überprüft. Aufgrund des hohen benötigten Sauerstoffeintrages in die Zelllösungen mussten die venwendeten MTPs während des Schüttelns mit hohen Drehzahlen ausgemessen werden. Weiterhin wurden Fehlermechanismen wie die aus der Literatur bekannte „Elektrodenpolarisation" genauer untersucht und mit geometriebedingten Fehlern der verschiedenen Sensordesigns verglichen. Neben reinen Platinelektroden wurden auch Sensoren mit Iridiumoxidelektroden aufgebaut und getestet. Eine sinnvolle Venwendung dieses speziellen Elektrodenmaterials für die Messung der ß-Dispersion wurde erarbeitet und untersucht. Während der Entwicklung und dem Aufbau der unterschiedlichen Sensortypen musste ein den Anforderungen angepasster Messaufbau entworfen werden. Hierzu gehörte vor allem eine reproduzierbare und wieder verwendbare Ankopplung der MTP an das verwendete Messgerät. Gleichzeitig mussten mehrere Wannen der MTP für das Messgerät zugänglich sein. Dies wurde über einen zu entwickelnden Multiplexer realisiert, der eine automatische elektrische Adressierung einzelner Wannen erlaubte. In einem letzten Schritt wurden die aufgebauten und charakterisierten Sensoren bei Fermentationsprozessen eingesetzt. Ihre Anwendbarkeit wurde bei verschiedenen Zellkulturen wie Hansenula Polymorpha (Hefe) und Escherichia Coli (Bakterium) und unterschiedlichen Nährmedien untersucht. Die Generierung neuer Zielmoleküle durch die molekulare Biotechnologie hat zu einem riesigen Bedarf an effizienten und hochdurchsatzfähigen Screening (HTS)-Verfahren geführt. Hierfür müssen miniaturisierte Messverfahren entwickelt werden, die eine Bestimmung der Reaktionskinetiken im μl-Maßstab schon während des Screenings erlauben. Aufgrund ihrer einfachen Handhabung und ihrer hohen Expression stellen Bakterien und Hefen bevorzugte Produktionssysteme für Biomoleküle dar. In MTPs integrierte Impedanzmessverfahren wie das galvanisch entkoppelte oder das Vierpunkt-Messverfahren könnten eine Lösung dieses Problems darstellen. Durch das mittels der Sensoren gewonnene Wissen über Reaktionsmechanismen und -kinetiken könnten molekularbiologisch hergestellte Produkte schneller, sicherer und effizienter in den Markt eingeführt werden.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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Galvanic decoupled sensor for monitoring biomass concentration during fermentation processes, Sensors and Actuators B 111-112 370-375 (2005)
M.C. Hofmann, D. Ellersiek, F. Kensy, J. Büchs, W. Mokwa, U. Schnakenberg
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Galvanically decoupled impedance spectroscopy for biological high-throughput-screening in microtiter plates, Proc. Sensors, 2005 IEEE, 30 Oct. - 3 Nov. 2005, pp. 1157-1160 ISBN: 0-7803-9056-3
M. C. Hofmann, R. Schlierf, F. Kensy, J. Büchs, W. Mokwa, U. Schnakenberg
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Transponder-based sensor for monitoring electrical properties of biological cell solutions, Journal of Bioscience and Bioengineering 100 (2005) 172-177
M.C. Hofmann, F. Kensy, J. Büchs, W. Mokwa, U. Schnakenberg
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Investigation of New Impedance Sensor Electrodes in Orbital Shaked Microtiter Plates, "MME 2007 Book of Abstracts", pp. 363-366, ISBN: 978-972-98603-3-1
M.C. Hofmann, W. Mokwa, U. Schnakenberg
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Development of a Four Electrode Sensor Array for Impedance Spectroscopy in High Content Screenings of Fermentation Processes, book of abstracts of Biosensors Congress 2008
M.C. Hofmann, M. Funke, J. Büchs, W. Mokwa, U. Schnakenberg
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Micro-Bioreactors for Fed-Batch Fermentations with Integrated Online Monitoring and Microfluidic Devices, Biosensors and Bioelectronics 24 (2009) 1411-1416
A. Buchenauer, M.C. Hofmann, M. Funke, J. Büchs, W. Mokwa, U. Schnakenberg
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„Aufbau und Untersuchung integrierter Impedanzsensoren zur Beobachtung aerober Zelikulturen in Mikroreaktorarrays", Dissertation, 2009
Mirko Hofmann
