Massenspektrometer mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC-MS)
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Die Kombination von Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie wurde in der speziellen Ausführung mit einem Triple-Quadrupoldetektor zur hochempfindlichen Detektion und Quantifikation von modifizierten Ribonukleosiden konfiguriert und eingesetzt. Dabei standen drei Anwendungen im Fordergrund, nämlich die akkurate Quantifizierung bekannter Nukleoside, die Detektion von derivatisierten Nukleosiden, sowie die Identifizierung bisher unbekannter natürlicher Nukleosidmodifikationen in Nukleinsäuren. Die ersten Arbeiten zur Quantifizierung wurden unter Verwendung von synthetischen externen Standards zur Kalibrierung durchgeführt. Nachfolgend hat unser Labor die Biosynthese und Validierung von stabil isotopenmarkierten internen Standards (SILIS) aus mikrobiologischen Kulturen etabliert. Durch Fütterung von Bakterien bzw. Hefe mit 13C bzw. 15N Isoptopen wurden in den daraus isolierten Nukleinsäuren modifizierte Nukleoside als SILIS gewonnen und extern kalibriert. Die gleichen Präparationen kamen auch bei der Entdeckung zehn neuer Nukleosidmodifikationen zum Einsatz, deren Strukturen derzeit im Labor aufgeklärt werden. Die in diesen Arbeiten erwachsene Expertise wurde in zahlreichen Kooperationsprojekten zur absoluten bzw. relativen Quantifizierung von Modifikationen eingesetzt, unter anderem zur Bestimmung von Methyltransferase-abhängiger Synthese von m5C in RNA und DNA verschiedener Organismen, zur Bestimmung diverser hypermodifizierter Uridine die an Position 34 von tRNAs durch den Elongator Komplex synthetisiert werden, sowie von Pseudouridin, O-methylierten Ribosen, und m6A in diversen RNA Präparationen. Insgesamt haben diese Arbeiten neben neuen analytischen Techniken dazu beigetragen, eine Sichtweise von RNA Modifikationen zu entwickeln, in der diese dynamische regulatorische Einheiten darstellen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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"Related haloarchaeal pleomorphic viruses contain different genome types." Nucleic Acids Res. 2012 Jul;40(12):5523-34
Sencilo, A., Paulin, L., Kellner, S., Helm, M. & Roine, E.
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"RNA cytosine methylation by Dnmt2 and NSun2 promotes tRNA stability and protein synthesis Nat Struct Mol Biol. 2012 Sep;19(9):900-5.
Tuorto, F., Liebers, R., Musch, T., Schaefer, M., Hofmann, S., Kellner, S., Frye, M., Helm, M., Stoecklin, G. & Lyko, F.
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"Structure-Function Relationship of Substituted Bromomethylcoumarins in Nucleoside Specificity of RNA Alkylation “ PLoS One. 2013 Jul 3;8(7):e67945
Kellner, S., Kollar, L. B., Ochel, A., Ghate, M. & Helm, M.
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"Profiling of RNA modifications by multiplexed stable isotope labelling." Chem Commun (Camb). 2014 Apr 4;50(26):3516-8
Kellner, S., Neumann, J., Rosenkranz, D., Lebedeva, S., Ketting, R.F., Zischler, H., Schneider, D., & Helm, M.
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Partial Methylation at Am100 in 18S rRNA of Baker's Yeast Reveals Ribosome Heterogeneity on the Level of Eukaryotic rRNA Modification." PLoS One. 2014 Feb 28;9(2):e89640
Buchhaupt, M., Sharma,S., Kellner, S., Oswald, S.,Paetzold, M., Pfeifer, C., Watzinger, P., Schraeder, J., Helm, M., Entian, K.D.
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“Aberrant methylation of tRNAs links cellular stress to neurodevelopmental disorders.” EMBO J. 2014 Sep 17;33(18):2020-39
Blanco, S., Dietmann, S., Flores, J.V., Hussain, S., Kutter, C., Humphreys, P., Lukk, M., Lombard, P., Treps, L. Popis, M., Kellner, S., Hölter, S.M., Garret, L., Wurst, W., Becker, L., Klopstock, T., Fuchs, H., Gailus-Durner, V., Hrabe de Angelis, M., Karadottir, R.T., Helm, M., Ule, J., Gleeson, J.G., Odom, D.T., Frye, M.
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“Absolute and relative quantification of RNA modifications via biosynthetic isotopomers.” Nucleic Acids Res. 2014 Oct;42(18):e142
Kellner, S., Ochel, A., Thüring, K., Spenkuch, F., Neumann, J., Sharma, S., Entian, K.D., Schneider, D. & Helm, M.
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“Dye label interference with RNA modification reveals 5-fluorouridine as noncovalent inhibitor." Nucleic Acids Res. 2014 Nov 10;42(20):12735-45
Spenkuch, F., Hinze, G., Kellner, S., Kreutz, C., Micura, R., Basché, T. & Helm, M.
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Urmylation and tRNA thiolation functions of ubiquitin-like Uba4•Urm1 systems are conserved from yeast to man. FEBS Letters 2015 Apr 2;589(8):904-9
Juedes, A., Ebert, F., Baer, C., Thuering, K. L., Harrer, A., Klassen, R., Helm, M. & Schaffrath, R.
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“Phosphorylation of Elp1 by Hrr25 Is Required for Elongator-Dependent tRNA Modification in Yeast.” PLoS Genetics 2015 Jan 8;11(1):e1004931
Abdel-Fattah, W., Jablownski, D., Di Santo, R., Thuering, K.L., Scheidt, V., Hammermeister, A., Have, S. t., Helm, M., Schaffrath, R., Stark, M.J.R.
