Analysis of the glutaryl-CoA dehydrogenase multiprotein complex
Final Report Abstract
Im Rahmen des geförderten Projektes konnte die Zusammensetzung des GCDH-Multienzymkomplexes weiterführend analysiert werden. Mit dem BRET-Verfahren gelang der Nachweis multipler Interaktionen der verschiedenen GCDH-Interaktionspartner untereinander, so dass diese Experimente grundsätzlich die Existenz eines GCDH-Multienzymkomplexes bestätigten. Weiterhin gelang es mittels BRET, bisherige in vitro Befunde zur Interaktion von GCDH mit den mitochondrialen Matrixproteinen ALDH2, GLUD1 und PRDX3 in vivo zu verifizieren und zu quantifizieren, sowie die mitochondriale Lokalisation der Komplexe zu bestätigen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass ausgewählte GCDH-Varianten, die Aminosäurenreste auf der Proteinoberfläche betreffen, zu einer Erhöhung der Bindungsaffinität zwischen ETFB und GCDH führen. Dies könnte über eine gestörte Dissoziation beider Proteine eine verminderte GCDH-Aktivität zur Folge haben und damit die Funktion des GCDH- Multienzymkomplexes beeinträchtigen. Hinsichtlich der Interaktion zwischen GCDH und DLST konnte nachgewiesen werden, dass der Aminosäurenrest Tyr155 im GCDH-Protein an der direkten Bindungsstelle mit DLST beteiligt sein muss. Insgesamt konnte damit nachgewiesen werden, dass GCDH-Varianten, die nicht im aktiven Zentrum sondern auf der Proteinoberfläche lokalisiert sind, ihre Pathogenität über eine Störung von Interaktionen im GCDH-Multienzymkomplex vermitteln. Mittels vergleichender nativer Gelelektrophorese (BN-PAGE) von hepatischen Mitochondrien- Exktrakten aus Gcdh-defizienten und Wildtyp-Mäusen wurden drei neue GCDH-haltige höhermolekulare Proteinkomplexe identifiziert. Die massenspektrometrische Analyse dieser Komplexe führte zur Identifizierung von 72, 50 bzw. 85 neuen potentiellen GCDH- Interaktionspartnern. Diese Daten schaffen damit einen Ausgangspunkt für weiterführende Untersuchungen zu Zusammensetzung, Struktur und Funktion GCDH-haltiger Proteinkomplexe. Aus Voruntersuchungen war bekannt, dass missense Mutationen der GCDH zu einer verminderten Stabilität und einem schnelleren Abbau des GCDH-Proteins führen, und dass dieser Abbau im Mitochondrium erfolgt. Unbekannt war bislang, welche mitochondriale Protease für diesen vorzeitigen Abbau mutanter GCDH verantwortlich ist. Zur Bearbeitung dieser Frage wurde zunächst eine siRNA- Methode zur gezielten Herabregulation einzelner mitochondrialer Proteasen bei gleichzeitiger Co-Expression mit unterschiedlichen GCDH-Varianten etabliert. Bei Herabregulation der mitochondrialen Protease LONP1 zeigte sich eine erhöhte Stabilität der sonst rasch abgebauten p.R402W-GCDH. Zudem konnte eine direkte Interaktion zwischen GCDH und LONP1 nachgewiesen werden. Diese Befunde legen nahe, dass LONP1 für den Abbau von Wildtyp- und mutanter GCDH verantwortlich ist. Derzeit werden Untersuchungen dazu durchgeführt, ob eine Herabregulation von LONP1 auch zu einer Erhöhung der spezifischen Restaktivität des mutanten GCDH-Enzyms führt. Eine gezielte Hemmung des vorzeitigen mitochondrialen Abbaus mutanter GCDH könnte zukünftig Angriffspunkt für neue Therapien der GCDH-Defizienz darstellen. Im Rahmen des geförderten Projektes ergab sich als ganz neuer Aspekt die Identifizierung der Glutarylierung von Proteinen als neu entdeckte posttranslationale Modifikation. Aufgrund der bei GCDH-Defizienz erhöhten intrazellulären Konzentration von Glutaryl-CoA ist auch die Glutarylierung mitochondrialer Proteine deutlich erhöht. In Hirn- bzw. Lebergewebe Gcdh-defizienter Mäuse wurden 37 bzw. 154 glutarylierte mitochondriale Proteine identifiziert. Die Glutarylierung kann dabei sowohl zu einer Aktivierung als auch Inhibition verschiedener Enzyme führen, führt also auf verschiedenen Ebenen zu Veränderungen der mitochondrialen Funktionen. Dieser Mechanismus stellt einen ganz neuen Ansatz für das Verständnis der Pathophysiologie der GCDH-Defizienz dar. Die im Projekt erhobenen Befunde konnten hochrangig publiziert werden.
Publications
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Dimitrov B, Molema F, Williams M, Schmiesing J, Mühlhausen C, Baumgartner MR, Schumann A, and Kölker S
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