Elucidation of the epigenetic mechanisms underlying transgene activation by the HSP70A promoter in Chlamydomonas reinhardtii
Final Report Abstract
Die Stilllegung von Transgenen stellt ein Problem bei der Verwendung der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii sowohl für die Grundlagenforschung als auch für biotechnologische Anwendungen (molecular farming, biofuels) dar. Vorarbeiten ergaben, dass der Chlamydomonas HSP70A-Promotor der Stilllegung von Transgenen in diesem Organismus entgegenwirken kann, wenn er dem Transgen-kontrollierenden Promotor vorgeschaltet ist. Ziel dieses Projektes war, die molekularen Mechanismen zu verstehen wie der HSP70A-Promoter der Stilllegung von Transgenen entgegenwirkt. Zu diesem Zweck haben wir insgesamt 14 Konstrukte hergestellt, in denen verschiedene Varianten des HSP70A-Promotors dem RBCS2-Promotor vorgeschaltet waren, der wiederum die Expression des Zeocin-Resistenz vermittelnden ble-Gens kontrollierte. In Transformanden-Pools, die mit diesen Konstrukten hergestellt wurden, haben wir die ble-Genexpression sowie Nukleosomenbelegung, Histon H3/4-Acetylierung, H3K4-Mono-, Di- und Trimethylierung und H3K9-Monomethylierung in nativen und transgenen Promotoren quantifiziert und verglichen. Wir konnten zeigen, dass die Histone in Nukleosomen auf transgenen RBCS2-Promotoren durch Modifikationen charakterisiert sind, die typisch für repressives Chromatin sind. So war der Grad an H3/4-Acetylierung und H3K4-Trimethylierung sehr niedrig, während der Grad an H3K9-Monomethylierung sehr hoch war. Auch wenn der Chromatinstatus am transgenen HSP70A-Promotor deutlich repressiver war als am nativen HSP70A-Promotor, so trugen die Histone am transgenen HSP70A-Promotor verglichen zu denen am transgenen RBCS2- Promotor deutlich mehr H3/4-Acetylierung und H3K4-Trimethylierung und weniger H3K9-Monomethylierung. Bemerkenswert war, dass dieser weniger repressive Chromatinstatus vom transgenen HSP70A-Promotor auf den nachgeschalteten transgenen RBCS2-Promotor übertragen wurde, so dass dessen Chromatinstatus dem des nativen RBCS2-Promotors sehr nahe kam. Die Übertragung der für offenes Chromatin typischen Histonmodifikationen H3/4-Acetylierung und H3K4-Trimethylierung auf den nachgeschalteten RBSC2-Promotor als auch die Aktivierung der Transgen-Expression erforderten intakte Hitzeschockelemente HSE1/2 und 4 sowie eine intakte TATA-Box im HSP70A-Promotor. Auch war der Hitzeschockfaktor 1 (HSF1) für diesen Effekt als trans-aktivierender Faktor essentiell. Die Verringerung der H3K9- Monomethylierung am nachgeschalteten RBCS2-Promotor jedoch war unabhängig von HSEs, TATA-Box und HSF1 und wird offensichtlich durch noch unbekannte Sequenzen im proximalen HSP70A-Promotorbereich vermittelt, deren Orientierung zum nachgeschalteten RBCS2-Promotor essentiell ist. Wir konnten weiterhin zeigen, dass der offenere Chromatinzustand am transgenen HSP70A-RBCS2-Promotor nicht ausreichend ist um eine hohe Transgen-Expression zu vermitteln, sondern vielmehr die Folge aktiver Transkription ist, die durch konstitutive Bindung von HSF1 am HSP70A-Promotor vermittelt wird. Unsere Daten favorisieren ein Modell, nach dem HSF1 über den Mediator-Komplex und TFIID eine stabile Plattform am HSP70A-RBCS2-Promotor generiert, die eine erhöhte Rekrutierung von RNA-Polymerase II ermöglicht, die wiederum den offenen Chromatinzustand generiert.
Publications
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(2013) Heat shock factor 1 counteracts epigenetic silencing of nuclear transgenes in Chlamydomonas reinhardtii. Nucleic Acids Research 41, 5273-5289
Strenkert D, Schmollinger S, Schroda M
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(2015) Dissecting the contributions of GC content and codon usage to gene expression in the model alga Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal 84: 704-717
Barahimipour R, Strenkert D, Neupert J, Schroda M, Merchant SS, Bock R
