Hochauflösendes Fluoreszenzmikroskop
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Das hochauflösende Fluoreszenzmikroskop mit strukturierter Beleuchtung (SIM) wurde zur Darstellung von kleinsten zellulären Strukturen, Organellen und Proteinkomplexen, wie zum Beispiel Proteasomen, Endosomen, Synapsen oder primäre Cilien, benutzt. Einen wesentlichen Anteil stellten dabei glutamaterge Synapsen an neuromuskulären Endplatten (NMJs) von Drosophila Larven dar, die durch die Ausschüttung des Neurotransmitters Glutamat die Muskelkontraktionen steuern. Die mit spezifischen Antikörpern und fluoreszierenden Proteinen angefärbten Synapsen konnten individuell aufgelöst werden. Dabei gelang es definierte Nanodomänen für essentielle synaptische Proteine in und um Transmitter-ausschüttende Zonen aufzulösen und eine Karte mit den wahrscheinlichsten Aufenthaltsorten dieser Proteine zu erstellen. Durch die gesteigerte Auflösung konnte vor allem die Anordnung der präsynaptischen Proteine Bruchpilot und Cacophony und der postsynaptischen Glutamatrezeptor-Untereinheiten geklärt werden. Durch das bessere Verständnis der synaptischen Architektur werden die molekularen Vorgänge während Transmitterfreisetzung und Synapsenbildung besser verständlich. In einem weiteren Hauptprojekt wurde der molekulare Aufbau von primären Cilien untersucht. Cilien sind kleine Zellfortsätze (Länge 1-10 µm), die als Signal- und Kommunikationszentren dienen. Da sie in nahezu allen Tierklassen vorkommen und aus einem hochkonservierten Mikrotubuli-Gerüst aufgebaut sind, kommt es bei Fehlfunktionen zu schwerwiegenden physiologischen Störungen. Beim Menschen treten sogenannte Ciliopathien auf. Ziel dieses Projekts war daher die Struktur und Funktion von primären Cilien an Modellsystemen zu untersuchen, um die molekularen Ursachen dieser Krankheiten besser verstehen zu können. Mithilfe des hochauflösenden Mikroskops konnte nun erstmalig gezeigt werden, dass Proteasomen (Proteindegradationsmaschinen) an und in Cilien lokalisieren und dort Signal- und Strukturproteine degradieren. Die proteasomale Aktivität wird dabei durch das Protein Rpgrip1 reguliert. Ciliäre Proteasomen können deshalb einen direkten Einfluss auf die Aktivität von Signalen an diesen wichtigen Kommunikationsstrukturen ausüben. In Nebenprojekten wurde die präzise Lokalisation von Zelladhäsionsproteinen an zentralen Synapsen von Vertebraten untersucht. Durch Ko-Lokalisationsexperimente konnte die funktionelle Rolle von N-Cadherin und Neuroligin-1 in transsynaptischen Komplexen von primären Neuronen unterschieden werden. Die hochaufgelösten Aufnahmen zeigten dabei dynamische Verschiebungen der Adhäsionskomplexe zwischen aktiven und periaktiven Zonen in Abhängigkeit der synaptischen Aktivität. Weiterhin trug das SIM Mikroskop zum besseren Verständnis von Notch-vermittelten Signalprozessen in Imaginalscheiben von Drosophila Larven bei und lieferte Hinweise, dass die extrazelluläre Domäne von Notch beim Abbau ins Lumen reifer Endosomen ragt. Auch lieferte es für die Aufklärung des gerichteten Transportmechanismuses des bakteriellen Hämolysins A (HlyA) durch ein membrandurchspannendes Sekretionssystem entscheidende Hinweise. Das SIM Mikroskop wurde in das Center for Advanced Imaging (CAi) integriert und steht dort allen Arbeitsgruppen am Campus der Heinrich-Heine-Universität zur Verfügung. Es wurde auch als fester Bestandteil in Lehrveranstaltungen für Bachelor- und Masterstudenten des Fachbereichs Biologie eingesetzt, sowie im fachübergreifenden Mikroskopie-Modul "Bildgebende Fluoreszenzspektroskopie" des CAi.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
-
Directionality of substrate translocation of the hemolysin A Type I secretion system. Sci Rep. 2015 Jul 27;5:12470
Lenders MH, Weidtkamp-Peters S, Kleinschrodt D, Jaeger KE, Smits SH, Schmitt L
-
The transition zone protein Rpgrip1l regulates proteasomal activity at the primary cilium. J Cell Biol. 2015 Jul 6;210(1):115-33
Gerhardt C, Lier JM, Burmühl S, Struchtrup A, Deutschmann K, Vetter M, Leu T, Reeg S, Grune T, Rüther U
-
Platelets contribute to amyloid-β aggregation in cerebral vessels through integrin αIIbβ3-induced outside-in signaling and clusterin release. Sci Signal. 2016 May 24;9(429):ra52
Donner L, Fälker K, Gremer L, Klinker S, Pagani G, Ljungberg LU, Lothmann K, Rizzi F, Schaller M,Gohlke H, Willbold D, Grenegard M, Elvers M
