Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop
Final Report Abstract
Die Aufrechterhaltung der zellulären Redoxhomöostase ist essentiell für normalen Metabolismus. Gleichzeitig wird angenommen, dass Abweichungen vom steady-state sowohl in Richtung oxidativer Bedingungen als auch ein Überschießen reduktiver Prozesse wichtige Signale für die Umsteuerung des Metabolismus unter Stresseinwirkung darstellen können. Die Thiol-Redoxhomöostase wird ganz wesentlich durch das niedermolekulare Tripeptid Glutathion, das in seiner reduzierten Form GSH und in der oxidierten Form GSSG vorkommt, bestimmt. Mit Hilfe genetisch codierter GFP-basierter Redoxsensoren konnten wir mikroskopisch zeigen, dass der zelluläre Glutathionpool weitestgehend reduziert vorliegt und hochaktive Glutathionreduktasen nur niedrige nanomolare Konzentrationen an GSSG zurücklassen. Unsere Arbeiten konzentrieren sich auf die Kompartimentierung von Glutathion innerhalb der Zelle und den Membrantransport von GSH und GSSG. Die unter Verwendung des konfokalen Mikroskops durch Messung des Glutathion-Redoxpotentials auf subzellulärer Ebene gewonnen Daten deuten darauf hin, dass GSSG nicht effizient über Membranen transportiert wird. Nur für Mitochondrien lassen einige Ergebnisse einen Transport von GSSG durch den ABC-Transporter ATM3 in der inneren Mitochondrienmembran von Arabidopsis möglich erscheinen. Bei den entsprechenden Arbeiten handelt es sich sowohl um eigene Projekte am Modellsystem Arabidopsis als auch Untersuchungen an anderen pflanzlichen und tierischen Modellsystemen im Rahmen des Schwerpunktprogramms SPP1710. Weitere mikroskopische Arbeiten richten sich auf die Lokalisation von Proteinen nach Fusion mit autofluoreszierenden Proteinen. So konnten wir eindeutig zeigen, dass das Glutaredoxin GRXS15 in den Mitochondrien vorliegt. In weiteren laufenden Arbeiten konnte auch für verschiedene andere Proteine die subzelluläre Lokalisation eindeutig nachgewiesen werden und damit teilweise falsche Angaben in der Literatur kuriert werden (zum Zeitpunkt dieses Berichts im Druck bzw. noch unveröffentlicht). Im Fall von Membranproteinen im Endomembransystem entlang des sekretorischen Weges werden dabei auch redox-sensitive GFPs als fluoreszierende N-und C-terminale Tags eingesetzt, da sich aufgrund des Redoxgradienten über der Membran die Orientierung eines Transmembranproteins eindeutig zeigen lässt. Auf diesem Wege konnten wir die Topologie des im Golgi und trans-Golgi lokalisierten Phosphattransporters PHO1 zeigen (Arbeit im Druck). Ein wichtiger Teil unserer Arbeiten bezieht sich dabei auf die Weiterentwicklung von Sensoren und deren Applikation in verschiedenen biologischen Systemen. Ein Teil der eingesetzten Sensoren ist nicht ratiometrisch und kann nur bei einer Wellenlänge gemessen werden. Quantitative Aussagen aus den Bilddaten lassen sich in diesem Fall nur über die jeweilige Lebenszeit der Fluoreszenz gewinnen. Die Messung der Lebenszeit (Fluorescence Lifetime) erfolgt dabei mittels eines gepulsten hochfrequenten Lasers und einer Dokumentation von Einzelphotonen. Das Mikroskop wird weiter auch für die dynamische und quantitative Erfassung anderer physiologischer Parameter wie z.B. pH und Ca2+ mittels genetisch codierter Sensoren eingesetzt. Die Emmy-Noether Juniorgruppe um Markus Schwarzländer konnte dadurch einen Regulator des mitochondrialen Calcium-Uniporters identifizieren und funktional charakterisieren (Publikation zum Zeitpunkt des Berichts akzeptiert aber noch unveröffentlicht). Neben den Mitgliedern der Arbeitsgruppen Meyer und Schwarzländer wird das Mikroskop auch von anderen Arbeitsgruppen der Landwirtschaftlichen Fakultät und der Botanik intensiv für Proteinlokalisationen und die Visulisierung stressabhängiger physiologischer Änderungen genutzt, wobei sowohl genetisch codierte Sensoren als auch konventionelle Farbstoffe und immunologische Methoden zum Einsatz kommen.
Publications
-
(2013): Development of roGFP2‐derived redox probes for measurement of the glutathione redox potential in the cytosol of severely glutathione‐ deficient rml1 seedlings. Frontiers in Plant Science, 4: 506
Aller I, Rouhier N, Meyer AJ
-
(2014): A conserved mitochondrial ATP‐binding cassette transporter exports glutathione polysulfide for cytosolic metal cofactor assembly. Journal of Biological Chemistry, 289, 23264‐23274
Schaedler TA, Thornton JD, Kruse I, Schwarzländer M, Meyer AJ, van Veen HW, Balk J
-
(2014): Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening, 19, 379‐386
Albrecht SC, Sobotta MC, Bausewein D, Aller I, Hell R, Dick TP, Meyer AJ
-
(2015): Cell-type specific gene expression analyses by RNA-Seq reveal local high nitrate triggered lateral root initiation in shoot-borne roots of maize by modulating auxinrelated cell cycle-regulation. Plant Physiology, 69, 690-704
Yu P., Eggert K., von Wirén N., Li C., Hochholdinger F.
