Analytisches Durchflusszytometer mit Zellsorter-Funktion
Final Report Abstract
1. Funktionelle Charakterisierung von kleinen regulatorischen RNAs: Kleine regulatorische RNAs (sRNAs) sind post-transkriptionale Genexpressionsregulatoren, die beispielsweise in der bakteriellen Stressantwort oder Virulenz eine wichtige Rolle spielen. Die meisten sRNAs regulieren die Translation oder Stabilität von mRNAs durch imperfekte Basenpaar-Interaktionen mit ihren Ziel-mRNAs. Die sRNA-vermittelte Regulation kann mittels Durchflusszytometrieanalysen von Fluoreszenzreporterfusionen an die Zielgene validiert und quantitativ analysiert werden. Uns interessieren sRNAs besonders in Hinblick auf die bakterielle Virulenz und die Wechselwirkung pathogener Bakterien mit den befallenen Wirtszellen. Darüber hinaus interessieren wir uns dafür, welche Proteine mit sRNAs in einer Bakterienzelle interagieren und welche Konsequenzen diese RNA-Protein-Interaktionen für die bakterielle Genexpression haben. Als bakterielles Modell-Pathogen dient Salmonella Typhimurium. Salmonellen können eukaryontische Zellen invadieren und darin replizieren, was eine Bedrohung sowohl für die menschliche Gesundheit an sich, als auch die unserer Nutztiere darstellt. 2. Parallele Transkriptomanalysen von Wirt-Pathogen-Interaktionen: Neben Salmonellen sRNAs und sRNA-bindenden Proteinen, die für die Interaktion mit dem Wirt wichtig sein könnten, sind wir auch an regulatorischen nicht-kodierenden RNAs in der Wirtszelle interessiert, wie etwa an sogenannten long non-coding RNAs (lncRNAs). Als aktuelles Beispiel wäre die von uns entwickelte Methode zur parallelen Genexpressions-Analyse von Pathogen und Wirt namens „Dual RNA-seq“ zu nennen. Diese ermöglicht es uns sämtliche RNA-Klassen (kodierend und nicht-kodierend) einer Bakterien-infizierten Säugetierzelle zu detektieren und deren Expression im Laufe der Infektion zu quantifizieren. Es wurden zunächst unterschiedliche Säugetier-Zellen mit Salmonellen infiziert, welche ein fluoreszierendes Protein produzieren. Dieses ermöglichte es uns infizierte Wirtszellen (die ein Fluoreszenzsignal emmitierten) von nicht infizierten Zellen zu unterscheiden und physikalisch zu trennen. In einem weiteren Projekt wird nun versucht die parallele Transkriptomanalyse von Wirt und Pathogen von zweidimensionalen Zellkulturmodellen auf dreidimensionale Gewebemodelle zu übertragen. Dazu wird neben Salmonella ein weiteres wichtiges Pathogen, Campylobacter jejuni, studiert. Dabei wurden zunächst Caco-2 Zellen und konstitutiv Fluoreszenzprotein-exprimierende (GFP, dsRed, mCherry) Campylobacterstämme dem Sortierungs-Prozess im FACS Aria III unterzogen, mit dem Ziel, infizierte Zellpopulationen über Durchflusszytometrie anzureichern. Folgeexperimente konzentrierten sich auf die Optimierung der Abtrennung infizierter Zellpopulationen. 3. Quantifizierung der Genexpression in dem humanpathogenen Hefepilz Candida albicans: Das FACS-Gerät wurde zur Quantifizierung der Genexpression in dem humanpathogenen Hefepilz Candida albicans verwendet. Mit Hilfe des GFP-Reportergens wird die Rolle verschiedener Transkriptionsfaktoren bei der Expression von multidrug-Effluxpumpen und anderer Gene bestimmt und Unterschiede in der Regulation beider Allele bestimmter Gene untersucht. Außerdem konnten so funktionelle Domänen eines multidrug resistance-Regulators identifiziert sowie aktivierende Mutationen und Hybrid-Transkriptionsfaktoren charakterisiert werden. Weiterhin wurden die Geräte eingesetzt, um Signale zu identifizieren, die die Expression von Virulenz- und Resistenzgenen steuern. Das FACS-ARIA wird in derzeit laufenden Forschungsprojekten verwendet, in denen die Evolution von resistenten C. albicans und der Einfluss von Resistenzmutationen auf die Fitness des Pilzes sowie molekulare Mechanismen der Kompensation von fitness costs untersucht werden. Dazu werden mit GFP und RFP markierte Stämme in Kompetitionsexperimenten eingesetzt und zyklisch Subpopulationen aussortiert, um diese genotypisch und phänotypisch zu charakterisieren. 4. Interaktion von humanen monoklonalen Antikörpern mit Fcy-Rezeptoren auf Phagozyten: Es konnte gezeigt werden, dass die untersuchten Antikörper spezifisch an die Rezeptoren FcγRI und FcγRIIa von neutrophilen Granulozyten binden. Diese Ergebnisse waren wichtig, um die opsonisierenden Eigenschaften der Antikörper als Voraussetzung für die Phagozytose von opsonierten Staphylokokken zu bewerten. Weiterhin wurde das Gerät eingesetzt, um die Aktivierung von neutrophilen Phagozyten nach Phagozytose von opsonierten S. aureus zu bestimmen. Ein weiteres Projekt befasste sich mit der Zytokinexpression bei systemischen und lokalen Staphylococcus aureus-Infektionen im Mausmodell, die FACS-basiert quantifiziert wurde. Die Hauptnutzung des FACS ARIA III liegt im Bereich der Hochgeschwindigkeitssortierung von pathogenen Erregern und Wirtszellen. Bei der Gerätebeschaffung wurde der prinzipielle Einsatz für infektiologische Projekte berücksichtigt, um sich zu den immunologisch genutzten Geräten an der Fakultät abzugrenzen und das Risiko der Kontamination von immunologischen FACS-Geräten zu vermeiden. Besonders für Einzel-Zell-Projekte war dies essentiell.
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